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產品名稱	英文名稱	規格	貨號
BL21-Star(DE3)pLysS化學感受態細胞	BL21-Star(DE3)pLysS Chemically Competent Cell	10×100μl\|50×100μl	CS-01F97802

BL21 Star(DE3)pLysS菌株來源于BL21(DE3)，含有rne131突變(RNaseE基因)，RNaseE基因的突變降低了內源RNase的積累，增菌株細胞內mRNA的穩定性，從而提高異源蛋白的表達水平。

主要適用于T7啟動子表達載體(如 pET系列)的高水平蛋白表達，同時含有大腸桿菌RNA聚合酶，也可用于非 T7啟動子表達載體(pGEX，pMAL等)的蛋白表達。由于BL21 Star(DE3)菌株的異源基因基礎表達水平較高，所以不適合毒性蛋白的表達。BL21 Star(DE3)pLysS菌株攜帶pLysS質粒，具有氯抗性。pLysS含有表達T7的基因，T7可以作用于大腸桿菌細胞壁上的肽聚糖溶解大腸桿菌，還可與T7 RNA聚合酶結合抑制其轉錄活性，進而降低目的基因的背景表達水平，但不干擾IPTG誘導的表達。pLysS質粒含有p15A復制起始子，可以和含有pUC或pBR322等復制起始子的質粒兼容。

BL21 Star(DE3)pLysS感受態細胞由特殊工藝制作，pUC19質粒檢測轉化效率達107 cfu/μg DNA。

保存條件：-80℃

基因型：

F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm rne131(DE3)pLysS(CamR)

操作說明：

1.BL21 Star(DE3)pLysS感受態細胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的質粒并用手EP管底輕輕混勻，冰中靜置25分鐘。

2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動會降低轉化效率。

3.向離心管中加入700 μl不含抗生素的無菌培養基(2YT或LB)，混勻后37℃，200 rpm復蘇60分鐘。

4.5000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應抗生素的2YT或LB培養基上。

5.將平板倒置放于37℃培養箱過夜培養。

注意事項：

1.感受態細胞好在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內加入目標DNA，不可在冰中放置時間過長，長時間存放會降低轉化效率。

2.混入質粒時應輕柔操作。

3.轉化高濃度的質粒可相應減少終用于涂板的菌量。

4.誘導時，IPTG濃度可選(0.1-2mM均可)。

5.為獲得需要量的蛋白，佳誘導時間，溫度，IPTG濃度需實驗者優化。
6.BL21 Star(DE3)pLysS菌株攜帶pLysS質粒，除復蘇培養基為無抗生素外，其余所用培養基、培養液均應含有34μg/ml氯，以防質粒丟失。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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