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F-BL21(DE3)化學感受態細胞

  • 產品貨號：CS-01F97791
  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
  • 采購熱度：252
  • 庫存：100
  • CAS號：
  • 方法：
  • 含量：10×100μl|50×100μl
  • 品牌名稱:莼試
  • 分子式：
  • 分子量：

簡介內容：F-BL21(DE3)化學感受態細胞現貨供應，價格實惠。

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標簽:F-BL21(DE3)化學感受態細胞 10×100μl 50×100μl 

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英文名稱

規格

貨號

F-BL21(DE3)化學感受態細胞

F-BL21(DE3)Chemically Competent Cell

10×100μl|50×100μl

CS-01F97791

介紹

   BL21(DE3)菌株用于高效表達克隆于含有噬菌體T7啟動子的表達載體(如 pET系列)的基因。

λ噬菌體DE3區含有T7噬菌體RNA聚合酶，該區整合于BL21的染色體上，所以稱為BL21(DE3)。可同時表達T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶，用于pET系列，pGEX，pMAL等質粒的蛋白表達。F-BL21(DE3)感受態細胞經特殊工藝制作，無需42℃熱激，37℃孵育步驟，只需冰浴，10min內完成轉化、涂板操作，pUC19質粒檢測轉化效率可達1×107 cfu/μg DNA。

保存條件：-80℃

基因型：

F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3)

快速轉化操作方法(10min)：

1.提前10分鐘將用到的篩選培養基平板拿到37℃預熱。

2.F-BL21(DE3)感受態細胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA并用手EP管底輕輕混勻，冰中靜置5分鐘。

3.用200 μl槍將感受態細胞-DNA混合物轉移到已經37℃預熱的LB培養基上，涂均勻，表面無水漬。

4.將平板倒置放于37℃培養箱過夜培養。

快速熱激轉化操作方法(25min,可提高轉化效率)

1.F-BL21(DE3)感受態細胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA并用手EP管底輕輕混勻,，冰中靜置5分鐘。

2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘(晃動會降低轉化效率)。加入700 μl不含抗生素的LB，37℃，200 rpm復蘇10分鐘，涂板(均勻，表面無水漬)。
3.將平板倒置放于37℃培養箱過夜培養
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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