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大腸桿菌經Ca離子處理后可攝取外源DNA(Plasmid、Phage DNA)，處于這種狀態(tài)的細胞稱作感受態(tài)細胞(Competent Cells)。在進行基因重組時，使用感受態(tài)細胞的轉化實驗應用十分廣泛。制作基因文庫、重組質粒體以及進行亞克隆實驗時，特別是目的基因含量十分低的情況下時，使用高效的感受態(tài)細胞十分重要。使用pUC57質粒檢測該DH10B感受態(tài)細胞，轉化效率可達107～108。在-70℃下保存數月轉化效率不發(fā)生明顯降低。

英文名稱：DH10B Competent Cells

產品規(guī)格：10×100μl

操作方法：

1．取出感受態(tài)細胞，置于冰上5分鐘，解凍。

2．向感受態(tài)細胞中加入1-10μl連接產物，輕彈離心管底部混勻，冰上放置30 min。

3．置于42℃熱激60s后，迅速置于冰上急冷2分鐘。

4．向熱激完畢的感受態(tài)細胞中，加入700μl經37℃預熱的LB(或SOC)培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃振蕩（225 rpm）培養(yǎng)1小時。目的是使質粒上相關的抗性標記基因表達，使菌體復蘇。

5．室溫4,000 rpm離心5分鐘，棄去700μl上清后，用剩余100μl培養(yǎng)基重懸細胞并涂布到含相應抗生素的LB瓊脂平板表面。

6．將平板置于37℃培養(yǎng)，12~14小時后可出現菌落。

注意事項：

1．感受態(tài)細胞應保存在-70℃，不可多次凍融和放置時間過長，以避免降低感受態(tài)細胞的轉化效率。

2．所有操作均需注意無菌操作。

3．pUC18 plasmid 標準品（0.2 ng/μl），含有氨芐青抗性，作為陽性對照使用，每次轉化5μl，可以得到約100～1000個克隆。
儲存條件：-80℃可保存一年。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術有限公司

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