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pEGFP-N1 哺乳動物表達載體

  • 產品貨號：CS-01F97723
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  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
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  • 含量：20μl
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：pEGFP-N1 哺乳動物表達載體現貨供應，價格實惠。

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標簽:pEGFP-N1 哺乳動物表達載體 20μl 

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pEGFP-N1 哺乳動物表達載體

 

20μl

CS-01F97723

GFP-N1編碼野生型GFP的一個紅移變體，已被優化，有更亮的熒光，在哺乳細胞有更高的表達，(大激發波長=488nm，大釋放波長=507nm)。

EGFP基因編碼序列，含有過190個沉默堿基的變化，這符合人類密碼子使用偏好。

EGFP序列的一側已經轉變成和KozaK一致的翻譯起始位點，進一步提高了在真核細胞的翻譯效率。

啟動子：CMV

復制子：pUC ori，f1 ori

終止子：SV40 ploy(A)

載體別名：pEGFPN1，pEGFP N1

載體分類：哺乳細胞表達載體，熒光蛋白報告載體

載體大。4733bp

載體標簽：增型熒光蛋白報告基因EGFP

原核抗性：卡那(Kanamycin)

篩選標記：新(Neomycin)

克隆菌株：DH5α

表達宿主：哺乳細胞

培養條件：37℃，LB培養基

5' 測序引物：CMV-F：5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'

3' 測序引物：EGFP-N：5'-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3'

備注：載體的MCS多克隆酶切位點，有EcoR I，BamH I等酶切位點。
儲存條件：-20℃
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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