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通用型T載體克隆菌落PCR檢測試劑盒

  • 產品貨號：CS-01F97681
  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
  • 采購熱度：257
  • 庫存：100
  • CAS號：
  • 方法：
  • 含量：80次|400次
  • 品牌名稱:莼試
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  • 分子量：

簡介內容：通用型T載體克隆菌落PCR檢測試劑盒現貨供應，價格實惠。

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標簽:通用型T載體克隆菌落PCR檢測試劑盒 80次 400次 

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貨號

通用型T載體克隆菌落PCR檢測試劑盒

Universal T vector colony PCR identification Kit

80次|400次

CS-01F97681

本試劑盒采用通用T載體引物研制的通用T載體菌落PCR鑒定試劑盒，只需購買一種試劑盒，便可用于市面上所有常見的T載體(包括pGEM，pUC，pBluescript系列) 連接陽性克隆的鑒定。此外，采用T3,T7或者SP6做引物的菌落PCR鑒定試劑盒引物距離插入位點的距離非常短，因此在鑒定100bp左右或者更小片段的插入時，陰性克隆的引物二聚體條帶和陽性克隆擴增條帶大小接近，無法區分。往往把引物二聚體的條帶看成是陽性擴增條帶，造成假陽性。反之，造成假陰性。本試劑盒通用T載體引物在未插入片段時的距離至少有150bp以上，加上插入片段的長度，可以清晰的區分是插入片段擴增出的條帶還是引物二聚體擴增出的條帶。避免假陽性或者假陰性，大大提高了準確性。本公司研發的一管便攜式PCR MasterMix預混系統，無需您一一加入各種成分，直接加入需篩選單菌落，經過1小時左右的PCR反應和電泳檢測即可得到重組菌落鑒定的結果。

試劑盒組份(400次)：

2 × Taq PCR MasterMix——————5ml

Universal primer F————————250μl

Universal primer R————————250μl

ddH2O———————————————5ml

注意事項：

1. 重組菌落鑒定時，挑取單菌落前，應先做好標記，便于鑒定后使用。

2. 挑取菌落時，應選擇單菌落，不要挑取太多菌體，以免影響PCR 結果。

3. 設定PCR 程序時，請根據插入片段大小決定延伸時間，如果插入片段大小為1 kb以下，延伸時間30-45 秒即可，如果片段更長，可按此比例增加延伸時間。
儲存條件：-20℃。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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