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一管式定點突變試劑盒

  • 產品貨號：CS-01F97678
  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
  • 采購熱度：218
  • 庫存：100
  • CAS號：
  • 方法：
  • 含量：10次|20次
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：一管式定點突變試劑盒現貨供應，價格實惠。

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標簽:一管式定點突變試劑盒 10次 20次 

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一管式定點突變試劑盒

One Tube Site-specific Mutagenesis Kit

10次|20次

CS-01F97678

本試劑盒是基于PCR原理向目的DNA片段（一般為質粒）中引入堿基的點突變，多個鄰近密碼子的突變，單個或多個鄰近密碼子的缺失(deletion)或插入(insertion)等。一般宿主菌培養擴增的質粒DNA是甲基化的，PCR擴增新合成的DNA是非甲基化的。先以待突變的甲基化質粒為模板，利用快高保真的SuperPfu聚合酶實現突變質粒的合成（非甲基化，包含突變點，且有兩個缺刻點nick點），再利用Dpn I酶選擇性降解甲基化的模板質粒 ，剩下的新合成非甲基化的突變質粒轉入大腸桿菌后，質粒中有兩個nick位點可以被大腸桿菌修復，得到的克隆就會含有預期的突變質粒了。一般可以產生大于90%的突變效率。本試劑盒適用于<12kb甲基化質粒中核苷酸的突變。

試劑盒組分(10次)：

SuperPfu DNA polymerase——————5μl

10×SuperPfu Buffer————————100μl

Dpn I——————-——————-——5μl

10mM dNTP Mixture-——————-——25μl

試劑盒特點：

1、簡單，一個PCR管中完成所有操作，速度快。

2、采用部分重疊引物設計，使PCR呈指數擴增，擴增產物凝膠電泳可見增加成功率。

3、效率高，使用Dpn I去除非突變模板，突變效率高達90%；不需要使用特殊感受態細胞降解非突變質粒。

4、采用分子進化改造的SuperPfu可以提供4倍-6倍于pfu的擴增速率提高和3倍于pfu的高保真性。
儲存條件：-20℃，有效期一年。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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