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本試劑采用獨特配方的陽離子聚合物為主要成分，可以與DNA形成穩定的復合物，保護DNA免受核酸酶的降解,在增加核酸穩定性的同時, 提高轉染試劑/DNA復合體穿越細胞膜的效率，這種獨特設計，顯著提高了基因轉染效率。此類試劑是目前非病毒介導方法中效率高的轉染試劑（不同種類細胞的轉染效率可有明顯差異）。此外本品不被血清清除，血清和抗生素不影響其轉染效果，轉染試劑/DNA復合物可以直接加入完全細胞培養基中。本品的細胞毒性很小，在適宜的條件下，根據推薦用量使用本試劑進行轉染實驗，細胞存活率高于90%.每一批產品出廠前都要對其轉染效率和毒性經過嚴格質控。 1ml本DNA轉染試劑可進行500次轉染（6孔板或35mm平皿）。

產品特點

1.適應于眾多原代培養細胞和轉化細胞株的基因轉染

2.適用于瞬時轉染和穩定轉染

3.適應于貼壁細胞和懸浮細胞轉染

4.轉染效率高且穩定，在有無血清存在的細胞培養基中均能獲得高效率轉染

5.細胞毒性低

6..轉染程序簡單，轉染實驗可以在半小時內完成

注意事項：

1. 少量使用本試劑時，可取精確量的本試劑用無菌純水稀釋一定倍數，以便精確取樣量。該稀釋液可在4℃保存1月左右。

2. 細胞的生長狀態是轉染效率的一個主要決定因素。在實驗條件許可的情況下，使用高質量的培養液、優質血清等，可能會明顯提高轉染效率。

3. 本試劑在轉染中不受血清影響，所以本試劑/DNA復合物能直接加到含血清的培養基中，但稀釋本試劑和DNA的緩沖液不能混有血清，因為本品在制備本試劑/DNA復合物之前可能會與血清中的蛋白質反應，影響轉染效率。

4. 如果細胞株很敏感，孵育2～4小時后除去轉染復合物并加入含血清的新鮮培養基。
儲存條件：4℃，有效期1年。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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