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定點突變試劑盒

  • 產品貨號：CS-01F97666
  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
  • 采購熱度：283
  • 庫存：100
  • CAS號：
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  • 含量：10T
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：定點突變試劑盒現貨供應，價格實惠。

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標簽:定點突變試劑盒 10T 

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定點突變試劑盒

HiperMut Site-Directed Mutagenesis Kit

10T

CS-01F97666

本試劑盒是基于HiperClone快速克隆技術的定點突變系統。使用本試劑盒，目標質粒擴增產物經DpnI消化、HiperClone重組環化后直接進行轉化即可完成定點突變。

本試劑盒由兩個模塊組成：Hiper II Pfu DNA聚合酶擴增模塊和HiperClone快速克隆模塊。Hiper II Pfu DNA聚合酶高的保真度顯著降低了擴增過程中引入新突變的可能性，其的長片段擴增能力，廣泛適用于長度小于20kb的任何質粒擴增。HiperClone快速克隆系統利用高效的同源重組反應替代傳統的退火成環反應。因此使用HiperMut定點突變試劑盒進行DNA定點突變時，引物設計更加靈活，且擴增反應不再需要以線性方式進行，極大減少了模板使用量，有利于原始甲基化模板的徹底降解。HiperClone技術可以高效完成兩個PCR產物的無縫拼接，因此該試劑盒還能以單次擴增的方式對目標質粒上不連續的兩個位點同時進行突變。

本試劑盒中的重組酶Exnase經過優化，專門針對單堿基、不連續雙堿基定點突變。此外，如擴增產物特異，其DpnI消化產物可不進行DNA純化而直接用于重組反應。高度優化的反應緩沖液、快捷的操作流程以及極高的成功率，使得本試劑盒成為DNA定點突變選產品。
保存：-20℃，有效期1年。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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