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Simple Cloning T載體(pSC-T)

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  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
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  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：Simple Cloning T載體(pSC-T)現貨供應，價格實惠。

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Simple Cloning T載體(pSC-T)

Simple Cloning T-Vector(pSC-T)

20次

CS-01F97650

本品是一種PCR產物高效TA克隆的專用T載體，它由pUC18載體改造而成。在PCR克隆構建過程中，為了進一步的克隆步驟，常會在PCR產物的兩端引入專門的酶切位點，如T載體上已帶有相同的酶切位點，會對下一步的酶切連接帶來不利的影響。為消除多克隆酶切位點帶來的負作用，Simple Cloning T-vector去除了PCR產物插入區域兩側所有的酶切位點。PCR產物克隆后如果使用其兩 端的酶切位點進行酶切時，T載體上不會有相同的酶切位點影響酶切反應，可以大大提高酶切效率，增加亞克隆成功率。多克隆位點的消除并不影響β-半乳糖苷酶的正常表達，PCR產物克隆后仍可以利用α-互補性進行藍白斑篩選，挑選陽性克隆。由于本載體上消除了多克隆酶切位點，克隆后的PCR產物將無法使用載體上的限制酶切下，需要在PCR擴增引物上導入合適的酶切位點。

產品特點：

1、15分鐘快速連接：

· 隨酶提供獨特配方的2×快速及10×普通T4 DNA Ligation Buffer。

· 使用2×快速Buffer在室溫(25℃)下，僅需15分鐘即可完成連接反應。

2、自帶快PCR鑒定2×Fast Taq MasterMix及DNA Marker：
2×Fast Taq MasterMix (Quick Load型)已含有PCR反應所需的快速型PCR聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、上樣染料以及反應緩沖液預先，使用時只需再加入模板和引物并稀釋到1倍濃度即可進行PCR反應。其擴增速度為普通Taq酶的數倍，因此可大幅度縮短PCR鑒定過程所需要的時間，自帶預混1×Loading Buffer的DNA Ladder 2000 Plus，能滿足絕大部分PCR產物電泳的需要。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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