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感受態細胞快速制備試劑盒

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  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
  • 采購熱度：185
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  • 含量：200次
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：感受態細胞快速制備試劑盒現貨供應，價格實惠。

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標簽:感受態細胞快速制備試劑盒 200次 

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感受態細胞快速制備試劑盒

One Step Competent Cell Preparation Kit

200次

CS-01F97619

使用本試劑盒操作非常簡單，細菌培養好后僅需十幾分鐘就可以完成感受態細菌的制備。本試劑盒適用于絕大部分常見的大腸桿菌，包括DH5α、JM109、TG1、HB101和XL-1等。對于一些用于蛋白表達或病毒質粒構建的特殊大腸桿菌也適用，制備出來的感受態菌轉化質粒肯定沒有問題，但如果轉化連接產物有時效果不如DH5α等其它常見的細菌。本試劑盒提供了DH5α甘油菌作為菌種，可以用于制備感受態細菌。本試劑盒可以分多次使用，共可以制備足夠進行200-400次轉化的感受態細菌。

本試劑盒是一種用于大腸桿菌感受態細菌快速制備的試劑盒。一步法感受態細菌制備試劑盒是在經典的TSS法的基礎上進行適當改良而成，既繼承了TSS法的快速和簡便，又在此基礎上提高了感受態細菌的轉化效率和易操作性。使用本試劑盒可以使感受態效率達到106以上。不僅可以轉化質粒，而且可以轉化普通的連接產物。另外，對細菌的培養條件要求比較寬松，培養的細菌只要處于對數期內就可以使用本試劑盒制備感受態細菌。

注意事項：

1. 需自行配制LB液體培養基和LB平板以用于細菌的培養和感受態效率的檢測。

2. 盡管經過我們的測試凡是處于對數期內的細菌都可以用于感受態細菌的制備，但如果細菌生長的OD600的值達到0.3-0.5左右時，制備出來的感受態效果佳。

3. 在制備感受態細菌的過程中均使用不含抗生素的LB。在使用感受態菌的過程中熱休克后的37℃培養時也必須使用無抗生素的LB，即便轉入的質粒是有抗性的。
儲存條件：-20℃，有效期一年。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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