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pGL6-miR的主要工作原理是，把目的基因的3’非翻譯區(qū)(3’-untranslated region, 3’-UTR)或其它適當(dāng)序列插入到螢光素酶基因(luc2)的下游，轉(zhuǎn)染細(xì)胞并檢測(cè)螢光素酶的表達(dá)。如果細(xì)胞內(nèi)源或外源表達(dá)的miRNA與靶序列結(jié)合，通常會(huì)抑制螢光素酶的翻譯或促進(jìn)mRNA的降解，從而使螢光素酶的表達(dá)量減少。因此通過(guò)本報(bào)告基因質(zhì)粒檢測(cè)螢光素酶的表達(dá)水平，可以檢測(cè)內(nèi)源或外源表達(dá)的miRNA是否對(duì)插入的靶序列有調(diào)控作用。并且可以通過(guò)靶序列中預(yù)測(cè)的miRNA結(jié)合位點(diǎn)的突變，用于比較突變前后螢光素酶表達(dá)水平的變化。如果預(yù)測(cè)的miRNA位點(diǎn)突變后，miRNA的調(diào)控作用消失，則基本上說(shuō)明突變的位點(diǎn)就是miRNA在靶序列中具體的結(jié)合位點(diǎn)。

pGL6-miR報(bào)告基因質(zhì)粒是一種用于microRNA(miRNA)等研究的螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒。該質(zhì)粒可用于把目的基因的3’非翻譯區(qū)(3’-untranslated region, 3’-UTR)或其它適當(dāng)序列插入到其多克隆位點(diǎn)，然后在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高靈敏度地檢測(cè)特定microRNA(miRNA)或其它非編碼RNA等對(duì)該基因3’-UTR或其它靶序列調(diào)控活性的報(bào)告基因質(zhì)粒。

pGL6-miR以pGL6質(zhì)粒為模板，具有氨芐青抗性，并在螢火蟲(chóng)螢光素酶基因之后添加了多克隆位點(diǎn)，便于插入目的基因的3’-UTR或其它適當(dāng)?shù)陌行蛄小?/span>

pGL6-miR帶有中低等度的PGK啟動(dòng)子，有利于檢測(cè)miRNA等對(duì)于螢火蟲(chóng)螢光素酶表達(dá)水平的下調(diào)作用，即當(dāng)miRNA的抑制作用較弱時(shí)也能檢測(cè)到。并且PGK啟動(dòng)子可以在人、大鼠、小鼠甚至酵母細(xì)胞中都可以發(fā)揮作用。

使用說(shuō)明：

1. 使用時(shí)請(qǐng)先取少量本質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行質(zhì)粒小量、中量或大量抽提后再用于后續(xù)用途。抽提獲得的質(zhì)粒可以通過(guò)酶切電泳進(jìn)行鑒定，或通過(guò)測(cè)序進(jìn)行鑒定。

2. 插入靶序列：在pGL6-miR多克隆位點(diǎn)選取適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)，經(jīng)酶切處理后連入目的基因的3’-UTR或其它適當(dāng)?shù)陌行蛄小?/span>

3. 以此質(zhì)粒為模板構(gòu)建的質(zhì)粒可以用常規(guī)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞。檢測(cè)時(shí)可以采用螢火蟲(chóng)螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(YT271)或雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（YT273）。
儲(chǔ)存條件：-20℃。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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