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本轉染試劑是一種非常高效的新型轉染試劑，達到了國際主流轉染試劑的轉染效果。適用于把質粒、siRNA或其它形式的核酸包括DNA、RNA、寡核苷酸、以及核酸蛋白復合物或帶負電荷的蛋白轉染到真核細胞中，也可以用于活體動物的核酸轉染以用于基因治療。對于六孔板，一個包裝的本轉染試劑大約可以轉染100個孔；對于24孔板，一個包裝的本轉染試劑大約可以轉染500個孔。

LP2000轉染試劑對于常見的哺乳動物細胞具有非常高的轉染效率、重復性好、操作簡單、無明顯的細胞毒性，并且對于貼壁細胞和懸浮細胞都適用。

LP2000轉染試劑的使用方法和常用的Lipofectamine 2000 Reagent完全一致。并且經過對HEK293T、Hela、NIH3T3、HEK293FT、CHO等細胞的測試，轉染效率也和Lipofectamine 2000 Reagent相當甚至略高。

LP2000轉染試劑不僅適用于質粒、siRNA等單一成分的細胞轉染，也適合多個質粒或者質粒與siRNA等的組合轉染。

LP2000轉染試劑轉染過表達質粒后，通常24～48小時后達到較高的蛋白表達水平，并且很多情況下蛋白表達量在轉染后48小時顯著高于轉染后24小時；轉染siRNA通常3～5天后對于目的基因的下調水平會比較理想。

LP2000轉染試劑轉染細胞時，基本不受細胞培養液中的血清和抗生素的影響，即可以在血清和抗生素存在的情況下進行細胞轉染。但為了取得佳的轉染效果，推薦轉染時使用不含抗生素的含血清的細胞培養液。

LP2000轉染試劑的轉染效果可以通過轉染表達EGFP等熒光蛋白的質粒進行快速鑒定。

注意事項：

使用高純度的DNA或RNA有助于獲得較高的轉染效率。對于質粒，可以使用的質粒大量抽提試劑盒(YT003)進行抽提，以保證可以獲得較高的轉染效率。

轉染前細胞必須處于良好的生長狀態。

需自備不含抗生素的無血清培養液或Opti-MEM培養液或普通的DMEM培養液。

LP2000轉染試劑不能vortex或離心，宜緩慢晃動混勻。

LP2000轉染試劑使用后請立即蓋好蓋子，避免長時間暴露在空氣中，影響轉染效率。

保存條件：
4℃保存。長期不使用可以-20℃保存。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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