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大腸桿菌DH10Bac化學感受態細胞

  • 產品貨號：CS-01F97556
  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
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  • CAS號：
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  • 含量：0.1mL*10
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：大腸桿菌DH10Bac化學感受態細胞現貨供應，價格實惠。

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標簽:大腸桿菌DH10Bac化學感受態細胞 0 1mL*10 

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大腸桿菌DH10Bac化學感受態細胞

E.coli DH10Bac Chemical Competent Cell

0.1mL*10

CS-01F97556

介紹

 本產品是采用特殊工藝處理得到的大腸桿菌DH10 Bac感受態細胞，適用于昆蟲桿狀病毒Bac-to-Bac 系統中同源重組的菌株，用于產生重組Bacmid。使用pUC19質粒檢測，本產品轉化效率可達107CFU/μg。

DH10Bac細胞包含親本Bacmid bMON14272和輔助質粒 pMON7124。親本Bacmid 包含一個mini-F 復制子、卡那抗性基因、att Tn7 位點和lac Zα-互補因子。

輔助質粒包含tns ABCD 區域，該區域提供了mini-Tn7從供體質粒插入親本Bacmid 靶位點所需要的轉座蛋白。供體如pFastBac 系列質粒(pFastBac1，pFastBacDual等)含有Tn7R和Tn7L 同源重組臂，Tn7R和Tn7L 之間包含慶大抗性基因、昆蟲病毒多角體基因啟動子、多克隆位點和SV40 病毒的PolyA 加尾信號。當含有靶基因pFastBac的重組質粒轉化到DH10Bac細胞后，發生重組后就可產生重組Bacmid，提取純化重組Bacmid轉染昆蟲細胞Sf9或Sf21 就可以包裝產生昆蟲病毒。此外，DH10Bac細胞中的The φ80dlacZDM15基因的產物可以實現β-半乳糖苷酶的α-互補現象，用于重組bacmid的藍白斑篩選。

?菌株基因型為：F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1endA1 araD139 Δ(ara,leu)7697 galU galK λ-rpsL nupG/pMON14272/pMON7124。

儲存條件：干冰運輸、-80℃保存，避免反復凍融，有效期半年。

自備試劑：重組質粒、SOC或LB培養基等。

使用方法：

1. 制備含有如下抗生素的LB 固體平板：50 μ g/mL Kanamycin，7 μ g/mL gentamicin，10μg/mL tetracycline，100μg/mL X-gal，40μg/mL IPTG。

2. 取感受態細胞置于冰浴中。一次轉化感受態細胞的建議用量為50-100μl，可以根據實際情況分裝使用。

以下實驗以100μL感受態細胞為例。

3. 待感受態細胞融化后，向感受態細胞懸液中加入1-10 ng 重組質粒，用移液器輕輕吹打混勻，冰浴30分鐘。

4. 42℃熱擊90秒，迅速將離心管轉移到冰浴中，冰上靜置2-3分鐘。

5. 每個離心管中加入900μl 無菌的SOC(不含抗生素)，混勻后置于37℃ 搖床，200rpm 振蕩培養4小時。

6. 用 SOC培養基進行10倍梯度稀釋，如分成3個稀釋梯度10-1,10-2,10-3。

7. 取 100μl的各個梯度的培養物用于涂布。等平板中的液體完全吸收后，倒置平板，37℃培養24-48小時。

8. 保留剩余的菌液保存于4℃，視平板上菌落生長情況決定去留。

注意事項：

1. 涂布用量可根據具體實驗調整。

2. 新制備的固體培養基不易涂干，可將平板正置于37℃直至液體被吸收后再倒置培養。
3. 涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的轉化菌落數過少，可以將剩下的菌液再涂布新培養基進行培養。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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