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HB101菌株是E.coli K12菌株與E.coli B菌株的雜合產物(同時也是Stbl3的原始菌株)。recA13突變可有效抑制長片段末端重復區的重組，降低錯誤重組的概率；但不含核酸酶endA1突變，體內核酸酶含量較高，提取質粒時務必使用質粒提取試劑盒中去蛋白液。hsdS20 背景使HB101缺失內切酶系統，增了外源DNA的穩定性和提取質量。本產品是采用大腸桿菌HB101特殊工藝處理得到的感受態細胞，可用于DNA的化學轉化。

產品特點：

1. 具有鏈抗性。

2.基因型：F- mcrB mrr hsdS20(rB- mB-)recA13 leuB6 ara-14 proA2 lacY1galK2 xyl-5 mtl-1rpsL20((strR)glnV44λ-。

3. 不存在 lacIqZΔM15，不可用于藍、白斑篩選。

4. 該菌株遺傳性能穩定，使用方便，適用于各種基因重組實驗。

儲存條件：干冰運輸、-80℃保存，有效期半年。

自備試劑：目的DNA、SOC或LB培養基等。

使用方法：

1. 取感受態細胞置于冰浴中。一次轉化感受態細胞的建議用量為50-100μL，可以根據實際情況分裝使用。

以下實驗以50μL感受態細胞為例。

2. 待感受態細胞處于冰水混合狀態時，向感受態細胞懸液中加入目的DNA(根據實際情況加入適量的DNA，通常100μL感受態細胞能夠被1ng螺旋質粒DNA所飽和)，用移液器輕輕吹打混勻，冰浴25分鐘。

3. 42℃熱擊45秒，迅速將離心管轉移到冰浴中，冰上靜置2-3分鐘，晃動會降低轉化效率。

4. 每個離心管中加入450μL 無菌的SOC或LB培養基(不含抗生素)，混勻后置于37℃搖床，200rpm 振蕩培養60分鐘使菌體復蘇。

5. 根據實驗需求，取適量已轉化的感受態細胞，加到含有相應抗生素的SOC或LB固體瓊脂培養基上，用無菌的涂布棒將細胞均勻涂開，將平板置于37℃倒置培養12-16小時。

注意事項：

1. 混入質粒或連接產物時應輕柔操作。

2. 涂布用量可根據具體實驗調整。若轉化的DNA總量較多，可取少量轉化產物涂布平板；若轉化的DNA 總量較少，可取200-300μL轉化產物涂布平板。若預計的克隆數較少，可通過離心(5000rpm，1分鐘)收菌后吸除部分培養液，懸浮菌體后將其涂布于平板中。

3. 新制備的固體培養基不易涂干，可將平板正置于37℃直至液體被吸收后再倒置培養。
4. 涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的轉化菌落數過少，可以將剩下的菌液再涂布新培養基進行培養。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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