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釀酒酵母AH109化學感受態細胞

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  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
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  • 含量：10×100μL
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：釀酒酵母AH109化學感受態細胞現貨供應，價格實惠。

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標簽:釀酒酵母AH109化學感受態細胞 10×100μL 

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釀酒酵母AH109化學感受態細胞

E.coli AH109 Chemical Competent Cell

10×100μL

CS-01F97535

介紹

AH109菌株來源于PJ69-2A酵母菌株，將lacZ報告基因引入PJ69-2A誕生了AH109，此菌株是Clontech公司開發的GAL4系統酵母雙雜實驗用菌株，MATa型，可直接轉化質粒或與MATα型酵母菌株Y187通過mating操作進行蛋白互作驗證或篩庫試驗。Transformation marker為:trp1，leu2，報告基因為：lacZ，HIS3，ADE2，MEL1。AH109-GAL4酵母雙雜系統需要兩種質粒配套使用：PGBKT7和PGADT7。質粒PGBKT7的篩選標志為TRP1，用于表達DNA-BD(來自酵母轉錄因子GAL4N端1～174位氨基酸)與目標蛋白(Bait)的融合蛋白；質粒PGADT7的篩選標志為LEU，用于表達AD(GAL4 C端768～881位氨基酸)與目標蛋白(Prey)的融合蛋白。

GAL4系統原理：一個完整的酵母轉錄因子GAL4可分為功能上相互獨立的兩個結構域：位于N端1～174位氨基酸區段的DNA結合域(DNA-BD)和位于C端768～881位氨基酸區段的轉錄激活域(AD)。DNA-BD能夠識別GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并與之結合。而AD可以啟動UAS下游的基因進行轉錄。BD和AD單獨存在不能激活轉錄，但當二者接近時，則呈現完整的GAL4活性，使含有UAS的啟動子下游基因轉錄表達。正常條件下，BD不與AD結合，將要檢測的蛋白質分別與BD和AD融合，形成bait融合蛋白(bait -BD)和prey融合蛋白(prey-AD)，如果bait和prey發生相互作用，就會促使BD和AD的相互接近，形成完整的GAL4，從而激活報告基因的轉錄。AH109有四個報告基因：lacZ，HIS3，ADE2，MEL1，分別由三種不同的啟動子(GAL1，GAL2，MEL1)啟動，這三種啟動子只有GAL4識別的17bp核心區相同，其余部分均不同，大大降低了酵母雙雜假陽性發生的概率。本產品經特殊工藝制作而成，經PGADT7質粒檢測轉化效率為＞104cfu/μg DNA。感受態細胞干冰運輸、-80℃保存，Carrier DNA -20℃保存；PEG/LiAc 4℃保存；有效期半年。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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