產(chǎn)品目錄

本制品是一種使用的BloodTaq DNA Polymerase (Blood-resistant，貨號：YTB4081)或BloodTaq HF DNA Polymerase (Blood-resistant，貨號：YTB4082)時，克服因模板高GC含量所導(dǎo)致的PCR擴(kuò)增障礙的PCR增劑。高GC含量DNA片段的擴(kuò)增一直是分子生物學(xué)操作過程中的一個難點(diǎn)，本產(chǎn)品可用于含有肝素、檸檬酸鈉以及EDTA等抗凝血的直接PCR反應(yīng)，從而大大提高了高GC含量DNA模板的擴(kuò)增效率及擴(kuò)增的特異性。本產(chǎn)品也可以用于普通PCR時擴(kuò)增高GC含量的目的片段。

2×Blood PCR Enhancer可以適用于商業(yè)化的常見的多種耐血DNA聚合酶，如的BloodTaq DNA Polymerase (Blood-resistant，貨號：YTB4081)和BloodTaq HF DNA Polymerase (Blood-resistant，貨號：YTB4082)，NEB的Hemo KlenTaq等。

保存：-20℃

注意事項：

在使用本產(chǎn)品2×Blood PCR Enhancer的同時，必須同時使用和耐血DNA聚合酶配套的終濃度為1×的PCR Buffer。

本產(chǎn)品溶解時如果有結(jié)晶狀沉淀物，可以在50℃水浴溫育片刻促進(jìn)溶解，并確保完全溶解后使用。

請盡量使用新近采集的抗凝血樣本進(jìn)行檢測；如果是凍存的樣本，盡量避免反復(fù)凍融，以免在凍融過程中導(dǎo)致目的基因的斷裂和降解。

設(shè)置PCR反應(yīng)體系時，抗凝血的推薦用量為PCR體系總體積的5～10%左右，可以直接添加到PCR體系中，無需進(jìn)行任何額外處理。

PCR反應(yīng)結(jié)束之后，建議3000～5000g離心3～5min以沉淀血細(xì)胞碎片，便于吸取上清用于電泳分析等。

注意：由于抗凝血本身的原因，PCR結(jié)束后在PCR管底部會出現(xiàn)透明凝膠狀物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象。
由于PCR反應(yīng)非常靈敏，可以擴(kuò)增目的基因序列過1000萬倍，在操作時請注意避免微量待擴(kuò)增DNA的污染，并盡量考慮設(shè)置不加模板的空白對照以確認(rèn)是否有待擴(kuò)增DNA的污染。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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