產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
菌落直接PCR擴(kuò)增試劑盒	E.coli Colony Direct PCR Kit	20μL×400T\|20μL×2000T	CS-01F97519

介紹

本試劑盒是一種使用特別便捷的含有藍(lán)色和橙色染料(電泳位置分別約4kb和50bp)的2倍濃度的PCR預(yù)混液，含有2×Taq DNA Polymerase、2×PCR Buffer、2×dNTP和2×Loading Buffer等，只需加入大腸桿菌菌落或菌落稀釋物、引物和水即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且擴(kuò)增完畢后可以直接上樣電泳。本試劑盒主要適用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后陽性克隆的菌落PCR篩選和鑒定。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

本試劑盒對于大腸桿菌菌落的兼容性好。

本試劑盒經(jīng)過反復(fù)優(yōu)化，確保直接挑取菌落進(jìn)行PCR的擴(kuò)增效果良好，菌落的存在不會顯著干擾PCR反應(yīng)。

本試劑盒使用特別便捷。

菌落直接PCR試劑盒中提供的2×E.coli Colony Direct PCR Mix(Green)已經(jīng)含有所有的通用組分，用戶只需自備引物和水即可對大腸桿菌菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增。它大大簡化了PCR操作，使操作更加快捷，也減少了PCR操作過程中可能導(dǎo)致的污染，使PCR的重復(fù)性更好；同時2×E.coli Colony Direct PCR Mix(Green)中已經(jīng)包含了上樣緩沖液組分，PCR擴(kuò)增結(jié)束后即可直接上樣電泳，無需添加上樣緩沖液。

本試劑盒擴(kuò)增效果好。

本試劑盒可以擴(kuò)增出長達(dá)8kb的片段，但通常更適合用于擴(kuò)增2kb以下的DNA片段。

本試劑盒中提供了雙色染料，便于電泳時觀察電泳進(jìn)程。

本產(chǎn)品中加入了藍(lán)色和橙色的電泳示蹤染料(整體呈現(xiàn)綠色)，其在濃度為1%瓊脂糖膠中的遷移位置分別大約位于4kb和50bp處。PCR結(jié)束后可直接進(jìn)行電泳檢測，無需再添加上樣緩沖液。藍(lán)色和橙色示蹤染料不會影響對相應(yīng)DNA條帶的觀察和檢測。

本產(chǎn)品穩(wěn)定性高。

經(jīng)測試，本試劑盒反復(fù)凍融15次后對PCR的擴(kuò)增效果無顯著影響。反復(fù)凍融15次前后，使用不同引物擴(kuò)增100～1500bp間不同長度目的片段的效果如圖1所示。
保存：-20℃，至少一年有效。適當(dāng)避免反復(fù)凍融，如需頻繁使用，可取適量存放于4℃，至少3天內(nèi)有效。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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