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一步法熒光定量RT-PCR試劑盒(探針法)

  • 產品貨號：CS-01F97513
  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
  • 采購熱度：290
  • 庫存：100
  • CAS號：
  • 方法：
  • 含量：20μL×100T|20μL×500T
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：一步法熒光定量RT-PCR試劑盒(探針法)現貨供應，價格實惠。

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標簽:一步法熒光定量RT-PCR試劑盒(探針法) 20μL×100T 20μL×500T 

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一步法熒光定量RT-PCR試劑盒(探針法)

ByFast One-Step Probe qRT-PCR Kit

20μL×100T|20μL×500T

CS-01F97513

試劑盒是一種基于TaqMan等探針的用于一步法反轉錄實時熒光定量PCR，主要用于RNA的特異性高靈敏度定量檢測。由于使用的探針一般是TaqMan探針，所以本方法也常稱作TaqMan探針法。

本試劑盒以提取的RNA為模版，使用qPCR引物在同一反應管內連續進行反轉錄和熒光定量PCR，操作簡單快速，大限度地減少人為誤差，有效降低污染風險，節約PCR實驗的操作時間，檢測通量大。

本試劑盒整合了高效的BalbRT M-MuLV Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor和優異的抗體結合型熱啟動ByFast Taq DNA Polymerase，并優化了緩沖體系，反轉錄性能優、檢測靈敏度高、擴增特異性、反應穩定性好，非常適合于內源低豐度RNA、外源病毒RNA等微量RNA的檢測。

檢測原理：

探針法qPCR不使用熒光染料如SYBR Green等對PCR產物進行熒光染色，而是采用了熒光基團和淬滅基團(quencher)標記的DNA探針靶向擬通過PCR檢測的目標序列(設計的探針結合位點通常位于兩條引物結合位點之間)。正常情況下，探針上的淬滅基團由于空間上的熒光共振能力轉移(FRET)而導致熒光基團淬滅。在PCR反應擴增目標序列時，引物和探針都會退火到目標基因上，隨著引物的延伸，Taq酶的5'→3'外切酶活性會導致結合在目標序列上的探針從5’端開始逐漸被降解。探針的熒光基團和淬滅基團被Taq酶切開后，淬滅基團的作用消失，熒光基團就能正常地被激發光所激發而產生熒光了。每經過一個PCR循環，就會有更多的熒光基團被釋放，熒光度與新合成的目標片段數量成正比，從而就可以實現定量檢測了。探針通常是目標序列特異性的一段線性DNA，5'端標記FAM或HEX等熒光基團，3'端標記BHQ1、TAMRA或MGB等熒光淬滅基團。
保存：-20℃避光，盡量避免反復凍融，有效期2年。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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