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phi29 DNA聚合酶2.0

  • 產(chǎn)品貨號：CS-01F97512
  • 產(chǎn)品價格：電議
  • 產(chǎn)品產(chǎn)地：國產(chǎn)
  • 包裝類型:盒裝
  • 采購熱度：347
  • 庫存：100
  • CAS號：
  • 方法：
  • 含量：500U|10000U
  • 品牌名稱:莼試
  • 分子式：
  • 分子量：

簡介內(nèi)容：phi29 DNA聚合酶2.0現(xiàn)貨供應(yīng)，價格實惠。

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標(biāo)簽:phi29 DNA聚合酶2 0 500U 10000U 

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產(chǎn)品屬性： 

產(chǎn)品名稱

英文名稱

規(guī)格

貨號

phi29 DNA聚合酶2.0

phi29 DNA Polymerase 2.0

500U|10000U

CS-01F97512

產(chǎn)品特點：

鏈置換能力

連續(xù)合成能力

擴(kuò)增的高保真性

產(chǎn)品應(yīng)用：

DNA恒溫滾環(huán)擴(kuò)增

需鏈置換和DNA連續(xù)合成的反應(yīng)

質(zhì)粒快速復(fù)制

高保真快速復(fù)制

儲存：-20℃可保存3年。

單位定義：

一個活力單位即在42℃條件下，10分鐘內(nèi)催化0.5pmol dNTP的摻入反應(yīng)成為酸不溶性物質(zhì)所需的酶量。

注意事項：

1×phi29 Buffer：50mM Tris-HCl pH7.5，10mM MgCl2，10mM (NH4)2S04，4mM DTT。必要時可單獨額外添加終濃度1mM DTT和0.2mg/ml BSA，可提高反應(yīng)效率。

該酶的佳反應(yīng)溫度為42℃ （在30~42℃。均有活性）。

65℃ 10min即可使該酶失活。

根據(jù)實驗類型需要，調(diào)整dNTP的濃度100~500μM。

添加Yeast Pyrophosphatase（CAT#:MT0098）可提高DNA產(chǎn)量。
反應(yīng)引物3’端的硫代修飾可避免引物降解。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量
(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養(yǎng)細(xì)胞 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。
c．細(xì)胞懸液 離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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