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一步免提取RT-PCR試劑盒(探針法)

  • 產品貨號:CS-01F97488
  • 產品價格:電議
  • 產品產地:國產
  • 包裝類型:盒裝
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  • 庫存:100
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  • 方法:
  • 含量:25μl×200次|25μl×1000次
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容:一步免提取RT-PCR試劑盒(探針法)現貨供應,價格實惠。

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標簽:一步免提取RT-PCR試劑盒(探針法) 25μl×200次 25μl×1000次 

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一步免提取RT-PCR試劑盒(探針法)

Sample Direct RT-qPCR Kit

25μl×200|25μl×1000

CS-01F97488

本制品是采用探針法進行One-Step Real-Time RT-qPCR的專用試劑盒。使用時只需要加入檢測目的基因所需的引物、探針及模板樣品,即可快速開始反應。樣品數量較多時,本制品可以直接以含有RNA病毒等的生物樣品起始反應,無需進行RNA提取及純化。由于核酸提取、反轉錄、qPCR各反應在同一反應管中連續進行,大大提高了操作簡便性,減少了反應時間。從核酸提?。?/span>90℃)到反轉錄反應(55-65℃)連續進行,對于含有復雜高級結構的RNA病毒等的檢測也能發揮作用。cDNA合成后進行高擴增效率的PCR反應,探針發出的熒光可實時檢出。

對于重復檢測特定目的基因等的實驗,實驗環境中?;煊邢惹皺z測反應的擴增產物,本制品中含有能夠分解帶有dUTPPCR產物的UNG酶(Uracil N-Glycosylase),持續使用本制品能夠有效避免交叉污染造成的假陽性問題。

本制品對于肝素(血液)和腐殖酸(土壤)等各種阻害物質具有高耐受性,可用于從各種生物樣品直接起始進行病毒及細菌檢測,或基因的表達分析等應用。

保存條件:-20

工作原理:

1RT-PCR
RNA雖不能直接作為PCR的模板,但是通過使用反轉錄酶將RNA合成cDNA,就可以利用PCRRNA進行分析。這就是RT-PCR,是高靈敏度的RNA檢測方法。本制品使用One Step RT-PCR法,其原理如下圖所示。One Step RT-PCR先使用PCR用特異性引物(Reverse)進行反轉錄反應,然后以合成的cDNA為模板,經特異性引物(Forward,Reverse)進行PCR擴增,整個反應在同一個反應管中連續進行。

實驗步驟:
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可!固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞,每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml,用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定,不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c.細胞懸液 離心收集細胞,每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol,反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2.將勻漿樣品在室溫(15-30℃)放置5分鐘,使核酸蛋白復合物完全分離。
3.可選步驟:如樣品中含有較多蛋白質,脂肪,多糖或胞外物質(肌肉,植物結節部分等)可于2-8℃10000×g離心10分鐘,取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。處理脂肪組織時,上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,劇烈振蕩15秒,室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層:底層為黃色有機相,上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中,水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中,如要分離DNA和蛋白質可保留有機相,進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇,室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘,離心前看不出RNA沉淀,離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者:上海莼試生物技術有限公司

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