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一步免提取RT-PCR試劑盒(探針法)

  • 產品貨號：CS-01F97488
  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
  • 采購熱度：225
  • 庫存：100
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  • 含量：25μl×200次|25μl×1000次
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：一步免提取RT-PCR試劑盒(探針法)現貨供應，價格實惠。

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標簽:一步免提取RT-PCR試劑盒(探針法) 25μl×200次 25μl×1000次 

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一步免提取RT-PCR試劑盒(探針法)

Sample Direct RT-qPCR Kit

25μl×200次|25μl×1000次

CS-01F97488

本制品是采用探針法進行One-Step Real-Time RT-qPCR的專用試劑盒。使用時只需要加入檢測目的基因所需的引物、探針及模板樣品，即可快速開始反應。樣品數量較多時，本制品可以直接以含有RNA病毒等的生物樣品起始反應，無需進行RNA提取及純化。由于核酸提取、反轉錄、qPCR各反應在同一反應管中連續進行，大大提高了操作簡便性，減少了反應時間。從核酸提。90℃）到反轉錄反應（55-65℃）連續進行，對于含有復雜高級結構的RNA病毒等的檢測也能發揮作用。cDNA合成后進行高擴增效率的PCR反應，探針發出的熒光可實時檢出。

對于重復檢測特定目的基因等的實驗，實驗環境中；煊邢惹皺z測反應的擴增產物，本制品中含有能夠分解帶有dUTP的PCR產物的UNG酶（Uracil N-Glycosylase），持續使用本制品能夠有效避免交叉污染造成的假陽性問題。

本制品對于肝素（血液）和腐殖酸（土壤）等各種阻害物質具有高耐受性，可用于從各種生物樣品直接起始進行病毒及細菌檢測，或基因的表達分析等應用。

保存條件：-20℃

工作原理：

1．RT-PCR
RNA雖不能直接作為PCR的模板，但是通過使用反轉錄酶將RNA合成cDNA，就可以利用PCR對RNA進行分析。這就是RT-PCR，是高靈敏度的RNA檢測方法。本制品使用One Step RT-PCR法，其原理如下圖所示。One Step RT-PCR先使用PCR用特異性引物（Reverse）進行反轉錄反應，然后以合成的cDNA為模板，經特異性引物（Forward,Reverse）進行PCR擴增，整個反應在同一個反應管中連續進行。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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