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qPCR MasterMix(TaqMan探針法，高濃度ROX)

  • 產品貨號：CS-01F97485
  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
  • 采購熱度：281
  • 庫存：100
  • CAS號：
  • 方法：
  • 含量：1mL|5mL|25mL
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：qPCR MasterMix(TaqMan探針法，高濃度ROX)現貨供應，價格實惠。

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標簽:qPCR MasterMix(TaqMan探針法 高濃度ROX) 1mL 5mL 

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英文名稱

規格

貨號

qPCR MasterMix(TaqMan探針法，高濃度ROX)

2×ByFast Probe qPCR Mix(High ROX)

1mL|5mL|25mL

CS-01F97485

本制品是一種基于TaqMan等探針的用于實時熒光定量PCR，即探針法qPCR(Quantitative PCR)或real-time PCR的高品質預混液，主要用于cDNA和基因組DNA等的特異性高靈敏度定量檢測。由于使用的探針一般是TaqMan探針，所以本方法也常稱作TaqMan探針法。

本產品特別適合用于低豐度或高特異性的目的基因的定量或定性檢測。例如一些低豐度的mRNA、lncRNA、小RNA、微生物RNA反轉錄后的高靈敏度檢測，一些相似度較高的常規染料法難以區分的同源基因或者基因的SNP檢測。

本產品的特異性好、靈敏度高：特異性并不僅僅依賴于PCR引物，還依賴于探針的特異性，探針和目標基因發生特異性的結合和降解，才能生成熒光信號，檢測靈敏度和特異性通常要顯著高于使用SYBR Green等熒光染料的方法。

本產品可用于多重檢測：單個反應孔中，不同基因對應不同探針，不同探針對應不同熒光標記，即可進行多重熒光定量PCR檢測。經測試，在適當優化引物和探針后，本產品可同時用于2～3個基因的檢測。

本產品使用的ByFast Taq DNA Polymerase是一種與抗體結合的高品質熱啟動酶，能夠實現便捷高效的熱啟動。ByFast Taq DNA Polymerase中的Taq酶與抗Taq酶的單克隆抗體相互結合，從而抑制了Taq酶的DNA聚合酶活性，這樣可以有效避免在低溫條件下由引物和模板DNA非特異性退火或引物二聚體引起的非特異性擴增。在PCR反應的預變性步驟中抗體會被加熱失活，這樣可以確保僅在預變性后才會把Taq酶的活性釋放出來，預變性之前不會發生DNA聚合反應，從而大大提高了PCR反應的特異性、靈敏度和定量檢測的準確性。
本產品包含了ByFast Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、穩定劑和鎂離子等所有的通用組分，使操作更簡單、使用更便捷。用戶只需自備引物、探針、樣品DNA和去離子水即可。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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