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本試劑盒基于滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)，配備的phi29 DNA聚合酶具有鏈置換和連續(xù)合成特性，可連續(xù)合成長(zhǎng)達(dá)70kb的DNA片段。另外，該酶具有3’→5’外切酶校讀功能，合成的DNA片段保真性高。試劑盒配備的Random Hexamers為6堿基隨機(jī)引物可對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行指數(shù)放大（通常放大10000倍）。

技術(shù)原理：

滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA）是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種核酸恒溫?cái)U(kuò)增方法。以環(huán)狀DNA為模板，通過(guò)一個(gè)短的DNA引物（與部分環(huán)狀模板互補(bǔ)），在phi29 DNA聚合酶催化下將dNTPs轉(zhuǎn)變成單鏈DNA，此單鏈DNA包含成百上千個(gè)重復(fù)的模板互補(bǔ)片段。這種方法不僅可以直接擴(kuò)增DNA和RNA，還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶核酸的信號(hào)放大，靈敏度達(dá)到一個(gè)拷貝的核酸分子，因此在核酸檢測(cè)中具有很大的應(yīng)用價(jià)值和潛力。因其高靈敏度、高特異性和可操作性，RCA技術(shù)在基礎(chǔ)研究、實(shí)際檢測(cè)、醫(yī)療診斷及納米材料等方面都有很好的應(yīng)用，結(jié)合細(xì)胞原位檢測(cè)、單核苷酸多態(tài)性SNPs，蛋白質(zhì)分析、免疫芯片和全基因組的擴(kuò)增等研究都能發(fā)揮其巨大的優(yōu)勢(shì)。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

高靈敏度：?jiǎn)我?/span>RCA的擴(kuò)增效率成指數(shù)擴(kuò)大，可達(dá)104～105。

操作簡(jiǎn)單：恒溫?cái)U(kuò)增，程序簡(jiǎn)單化。

儀器簡(jiǎn)單：只需維持恒溫的水浴鍋。
應(yīng)用廣泛：可廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和醫(yī)療診斷等領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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