產品屬性：

產品名稱	英文名稱	規格	貨號
M-MuLV逆轉錄酶	M-MuLV Reverse Transcriptase	2kU\|10kU	CS-01F97385

儲存條件：冷凍（-20℃）

概述

M-MuLV逆轉錄酶（RT）是重組M-MuLV RT。它與M-MuLV RT的結構和催化性能不同。該酶具有RNA-依賴性和DNA-依賴性聚合酶活性以及特異于RNA-DNA雜交體中RNA的RNA酶H活性，其顯著低于禽成髓細胞瘤病毒（AMV）逆轉錄酶RNase H Minus的活性并且在廣泛的溫度（42?55℃）范圍內起作用。

特點

高效合成全長鏈cDNA至13 kb，在42℃時的佳活性高達50℃的活性加入修飾的核苷酸

應用

First strand cDNA synthesis for RT-PCR and real-time RT-PCR Synthesis of cDNA for cloning and expression Generation of labeled cDNA probes for microarrays DNA labeling Analysis of RNA by primer extension

儲存條件：冷凍（-20℃）

概述

M-MuLV逆轉錄酶（RT）是重組M-MuLV RT。它與M-MuLV RT的結構和催化性能不同。該酶具有RNA-依賴性和DNA-依賴性聚合酶活性以及特異于RNA-DNA雜交體中RNA的RNA酶H活性，其顯著低于禽成髓細胞瘤病毒（AMV）逆轉錄酶RNase H Minus的活性并且在廣泛的溫度（42?55℃）范圍內起作用。

特點

高效合成全長鏈cDNA至13 kb，在42℃時的佳活性高達50℃的活性加入修飾的核苷酸

應用

First strand cDNA synthesis for RT-PCR and real-time RT-PCR Synthesis of cDNA for cloning and expression Generation of labeled cDNA probes for microarrays DNA labeling Analysis of RNA by primer extension

儲存條件：冷凍（-20℃）

概述

具有3’→5’的外切酶活性，能糾正DNA擴增（PCR）過程中產生的錯誤，而傳統的Taq DNA聚合酶等都不具有這種功能。其他高溫DNA Polymerase如：Vent，DeepVent，Tli，UlTma等也具有校正功能，但是Pfu是目前已發現的所有DNA聚合酶中擴增DNA時出錯率低的。Pfu DNA聚合酶比普通的Taq DNA聚合酶熱穩定性更好，95℃，1小時仍保持90%以上的活力。

特點

8倍于Taq DNA聚合酶的準確度；高度熱穩定性：95℃孵育2小時后仍保持95%活性，產生平端PCR產物結合修飾的核苷酸（如，，熒光標記的核苷酸）

應用
高保真PCR，產生用于克隆和表達RT-PCR的PCR產物，用于cDNA克隆和表達，Blunt-end PCR克隆

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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