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產品名稱	英文名稱	規格	貨號
熒光定量檢測試劑盒（染料法)	2×QuantSmart qPCR PreMix （SYBR Green)	20μL×125次\|20μL×500次\|20μL×5000次	CS-01F97307

本制品是采用SYBR Green I嵌合熒光法進行Real-Time PCR的專用試劑，可對目標DNA進行快速、特異性的定量檢測。優化的預混液可縮短Real-Time PCR的反應時間，適用于標準或快速PCR儀。

2×QuantSmart qPCR PreMix采用了抗體修飾的Anti Taq DNA聚合酶，配合獨特的qPCR Buffer體系可確保本產品在所有的Real-Time PCR儀上進行高靈敏的快速qPCR反應，qPCR反應時間可縮短50%。此外，Buffer中添加了的H-Competitor因子和EP組分，還使得本產品具有廣泛的樣本普適性，對具有復雜高級結構的模板、PCR抑制劑殘留較多的模板以及長片段擴增等具有非常好的適用性。同時本產品還具有高擴增效率，高擴增特異性和寬廣的可信范圍等特點，在不影響PCR效果的前提下更快獲得結果，節約科研時間和能源。

產品特點：

2×QuantSmart qPCR PreMix采用了抗體修飾的Anti Taq DNA聚合酶，配合特制的快速qPCR Buffer體系，可大大縮短變性、退火與延伸時間，可節省多達50%的反應時間，快速獲得實驗結果。

本產品中特別添加了H-Competitor因子，能夠競爭氫鍵、增雙鏈的打開度，使本產品具有廣泛的樣本普適性，對具有復雜高級結構的模板和長片段擴增等具有非常好的適用性。

本產品特制的快速PCR Buffer體系含有獨特的PCR穩定因子——EP，能夠有效的保護酶活，抵御各種PCR抑制劑的干擾，保證了2×QuantSmart qPCR PreMix高擴增效率，高擴增特異性、高擴增靈敏度和寬廣的可信范圍的特點。

2×QuantSmart qPCR PreMix中預混有SYBR Green I，PCR反應液配制時，只需加入模板、引物、滅菌蒸餾水便可進行快速Real-Time PCR反應，操作簡單方便。

·本產品附帶ROX Reference Dye，用于消除信號本底以及校正孔與孔之間產生的熒光信號誤差，方便客戶針對不同型號熒光定量PCR儀時選擇對應濃度使用。
2×QuantSmart qPCR PreMix采用無色透明管包裝，經檢測，光照不會影響體系的定量的結果。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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