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SYBR Green I 染料是一種直接與雙鏈 DNA (dsDNA) 結合的熒光染料，是熒光定量PCR 常用的DNA結合染料。在定量 PCR中，SYBR Green I可與雙鏈DNA(dsDNA)非特異性結合后發出熒光，則可以通過檢測反應體系中的SYBR Green I 熒光度，達到檢測PCR 產物擴增量的目的。游離狀態下，SYBR Green I發出微弱的熒光，一旦與dsDNA結合，其熒光增加1000倍，一個反應發出的全部熒光信號與出現的dsDNA量成比例，且會隨擴增產物的增加而增加;所以通過檢測PCR 反應液中的熒光信號度，可以對目的基因進行準確定量，同時還可以測定擴增的目的DNA片段的熔解溫度。

使用說明：

使用時，配置PCR反應混合液，將10000×SYBR Green I濃縮液加入到PCR反應體系，使終濃度為0.5× (0.2×到1×之間調整)。以上操作建議在冰上進行。

注：

① 反應液配制方法和PCR 擴增條件請參照DNA聚合酶使用說明。

② Realtime PCR 擴增儀的使用方法，請參照各儀器說明書。

注意事項：

使用濃度對熒光PCR結果的影響

SYBR Green I的使用濃度是保證熒光定量PCR實驗成功非常關鍵的因素。如果SYBR Green I的濃度過低會使熒光信號的變化降低，這就意味著低拷貝的樣品可能無法檢出;而在高濃度時，將會抑制PCR反應，降低PCR反應效率。所以一般在使用SYBR Green I時應根據實際情況優化使用濃度，反應的終濃度為0.2×到1×之間。

鎂離子濃度的影響

提高鎂離子濃度可以降低SYBR Green I對PCR反應的抑制作用。我們建議在用SYBR Green I進行熒光PCR反應時，鎂離子濃度比無SYBR Green I 的普通 PCR 反應高出0.5～3mM。儲存條件：-20℃避光，有效期至少一年。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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