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2×Pfu PCR MasterMix

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  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
  • 采購熱度：203
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  • 含量：1ml×5
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：2×Pfu PCR MasterMix現貨供應，價格實惠。

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標簽:2×Pfu PCR MasterMix 1ml×5 

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2×Pfu PCR MasterMix

2×Pfu PCR MasterMix 

1ml×5

CS-01F97250

介紹

 本制品是將PCR反應所需的Pfu酶、dNTP、MgCl2、反應緩沖液以及優化劑以及穩定劑，預先配制成2倍濃度的混合物。2×Pfu PCR MasterMix專為擴增克隆DNA片段優化，高保真，錯誤率僅為1.3×10-6。使用 時只需在加入模板和引物并稀釋到1倍濃度即可進行PCR反應，非常方便。用于要求保真度比較高的PCR反應，包括克隆PCR、DNA片段拼接、引入突變、全基因合成等。

產品特點：

高保真：Pfu DNA聚合酶是使用廣泛的高保真酶，其保真度為普通Taq酶的10倍

靈敏：可從0.05ng人基因組DNA模板中擴增出特定基因片段（圖例一）

快捷：PCR反應所必需試劑全集于一管之中，數分鐘即可完成反應

便利：10μl，25μl 或50μl體系全部適用

使用建議：

Pfu DNA聚合酶產生的PCR產物為平滑末端，無3′端"A"突出，其PCR產物的克隆有幾種方案。

1、PCR前引物進行5′端加磷修飾或將PCR產物磷酸化處理后再直接克隆于平滑末端的載體中（參見實驗方案）。

2、將產物3′末端加A后再與T載體連接（參見實驗方案）。

3、引物中引入15bp與載體同源序列，利用BalbRec PCR產物一步定向無縫克隆試劑盒（Cat# JN0001）直接連接到目的載體。
由于Pfu DNA聚合酶的校對活性可引起引物從3′端被部分降解。因此在設計引物時應適當增加引物的長度，理想的引物長度為20-30堿基。另外為了減少由3′→5′外切酶活性引起的引物降解，盡量在冰上配制反應體系，并后加入Pfu酶。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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