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2×Fast Pfu PCR MasterMix

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  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
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  • CAS號：
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  • 含量：1ml
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：2×Fast Pfu PCR MasterMix現(xiàn)貨供應，價格實惠。

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標簽:2×Fast Pfu PCR MasterMix 1ml 

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2×Fast Pfu PCR MasterMix

 

1ml

CS-01F97240

本制品是將PCR反應所需的Fast Pfu酶、dNTP、MgCl2、反應緩沖液以及優(yōu)化劑以及穩(wěn)定劑，預先配制成2倍濃度的混合物。2×Fast Pfu PCR MasterMix專為擴增克隆DNA片段優(yōu)化，高保真，錯誤率僅為1.3x10-6。使用時只需在加入模板和引物并稀釋到1倍濃度即可進行PCR反應，非常方便。較普通Pfu酶，2×Fast Pfu PCR MasterMix具有快速、高靈敏度、抗干擾能力等特點，能獲得更理想的擴增結果，并大幅度縮短擴增反應時間。

本制品用于要求保真度比較高的PCR反應，包括克隆PCR、DNA片段拼接、引入突變、全基因合成等。

產品特點：

高保真：具有同Pfu酶相同的保真度，為普通Taq酶的10倍。

快速：Fast Pfu擴增速度為普通Pfu酶的數(shù)倍，72℃保溫30秒可延伸1kb以上。

靈敏：可從0.05ng人基因組DNA模板中擴增出特定基因片段

快捷：PCR反應所必需試劑全集于一管之中，數(shù)分鐘即可完成反應體系配制。

便利：10μl,25μl或50μl體系全部適用。

使用建議：

Fast Pfu DNA聚合酶產生的PCR產物為平滑末端，無3′端"A"突出，其PCR產物的克隆有兩種方案：

1、PCR前引物進行5′端加磷修飾或將PCR產物磷酸化處理后再直接克隆于平滑末端的載體中。

2、將產物3′末端加A后再與T載體連接。
由于Fast Pfu DNA聚合酶的校對活性可引起引物從3′端被部分降解。因此在設計引物時應適當增加引物的長度，理想的引物長度為20-30bp 堿基。另外為了減少由3′- 5′外切酶活性引起的引物降解，盡量在冰上配制反應體系。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數(shù))
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養(yǎng)細胞 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術有限公司

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