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PCR產物純化回收試劑盒(測序級)

  • 產品貨號：CS-01F97239
  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
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  • 含量：100次
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：PCR產物純化回收試劑盒(測序級)現貨供應，價格實惠。

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PCR產物純化回收試劑盒(測序級)

 

100次

CS-01F97239

本試劑盒利用核酸外切酶I和熱敏堿性磷酸酶，僅需簡單的保溫步驟，方便地去除多余的引物和dNTPs，凈化的PCR產物可直接用于測序反應，且不會

損失任何產物。此法可以避免繁瑣的膠回收、柱純化、沉淀、磁珠、過濾、透析等方法，大大節省實驗費用及時間。適用于大規模PCR產物凈化測序，大幅提高實

操作步驟：

1、取出7.5μl PCR反應混合物；

2、在反應混合物中加入0.5 μl (10 units)的核酸外切酶 I (20000 units/ml), 37℃反應15分鐘；

3、再加入1μl的10×AP Buffer 和1μl (5 units) 熱敏磷酸酶，37℃反應15分鐘；如果反應時間延長，可減少酶用量，需試驗驗證。熱失活核酸外切酶 I和熱

敏磷酸酶：80℃保溫20分鐘，終止反應。反應物可直接用于測序。

操作步驟：

1、取出7.5μl PCR反應混合物；

2、在反應混合物中加入0.5 μl (10 units)的核酸外切酶 I (20000 units/ml), 37℃反應15分鐘；

3、再加入1μl的10×AP Buffer 和1μl (5 units) 熱敏磷酸酶，37℃反應15分鐘；如果反應時間延長，可減少酶用量，需試驗驗證。熱失活核酸外切酶 I和熱

敏磷酸酶：80℃保溫20分鐘，終止反應。反應物可直接用于測序。

本試劑盒為您提供了8 種耐熱聚合酶和相應的精心配制的緩沖液，其中緩沖液的pH值，鹽離子濃度和助溶劑成分等各不相同，當擴增某些復雜的基因模板等出現問題時，應測試不同的聚合酶及反應緩沖體系。另外，本試劑盒還提供了PCR增劑，能增加引物的特異性，提高DNA聚合酶的熱穩定性，適應較寬范圍的退火溫度和Mg2+濃 度。可以在試劑盒提供的8種聚合酶及相應反應體系的基礎上再添加PCR增劑，以找到PCR適反應體系從而達到佳的PCR反應效果。

為什么選擇本試劑盒？
影響PCR反應的因素很多，如聚合酶本身的性質，pH值，酶保護劑，助溶劑等，只有在這些因素都是適的情況下才能獲得較好的擴增產物。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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