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耐熱逆轉錄酶II

  • 產品貨號：CS-01F97207
  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
  • 采購熱度：239
  • 庫存：100
  • CAS號：
  • 方法：
  • 含量：2000U
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：耐熱逆轉錄酶II現貨供應，價格實惠。

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標簽:耐熱逆轉錄酶II 2000U 

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貨號

耐熱逆轉錄酶II

Reverse Transcriptase II

2000U

CS-01F97207

Reverse Transcriptase（代耐熱逆轉錄酶）是Reverse Transcriptase（代耐熱逆轉錄）的升級產品，是在M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase基礎上通過體外分子進化技術獲得的全新耐熱逆轉錄酶。與上一代相比，進一步大幅提高了熱穩定性，50℃下半衰期過240min，并長時間耐受55℃高溫且保持穩定，非常適合具有復雜二級結構的RNA模板的逆轉錄。此外，增加了多個突變位點，進一步增了模板親和力和行進性，大幅提升全長cDNA的合成能力，可獲得長達20 kb的cDNA。另外，對于常見的逆轉錄抑制物具有更高的耐受度，非常適合于植物組織RNA的逆轉錄反應。

活性定義：以Poly(rA) Oligo(dT)為模板/引物，在37℃，10min內，摻入1 nmol的dTTP為酸不性溶物質所需要酶量定義為1個活性單位（U）。

質量控制

核酸外切酶殘留檢測：200 U本品和0.6 μg λ-Hind Ⅲ在37 oC下孵育1h，DNA的電泳譜帶不發生變化。

核酸內切酶殘留檢測：200 U本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在37 oC下孵育1h，DNA的電泳譜帶不發生變化。

RNase殘留檢測：200 U本品和1 μg小鼠總RNA在37 oC下孵育1h，RNA電泳譜帶不發生變化。

功能檢測1：逆轉錄體系中加入200 U本品，以100 pg Hela cell total RNA為模板，Oligo(dT)23為引物，50 oC反應30min。取10% cDNA產物進行PCR擴增β-actin基因。瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，可見有單一的550 bp條帶。

功能檢測2：逆轉錄體系中加入200 U本品，以500 ng Hela cell total RNA為模板，Oligo(dT)23為引物，55 oC反應45min。取10% cDNA產物進行PCR擴增Polε基因。瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，可見有單一的4.8 kb (GC-rich)條帶。
功能檢測3：逆轉錄體系中加入200 U本品，以1 pg-1 μg Hela cell total RNA為模板，Oligo(dT)23VN和Random Hexamers為引物，測試qRT-PCR 性能。以6個數量級的模板量的對數值對Ct值做標準曲線，R2>0.990，斜率在-3.20到-3.60之間。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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