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Long PCR Master Mix (With Dye)包含Long Taq DNA Polymerase，dNTP以及優(yōu)化的緩沖體系，只需加入引物和模板即可進行擴增，大大簡化實驗的操作步驟，提高了高通量操作和實驗結(jié)果的重現(xiàn)性。Long Taq DNA Polymerase是Taq DNA Polymerase與一種含有3’→5’外切酶活性（校對活性）的蛋白組成的混合酶，保真度是Taq DNA Polymerase的6倍。配合獨特的緩沖體系，Long Taq DNA Polymerase可從人基因組模板中擴增長達15 kb的片段。

Mix中含有電泳緩沖液和溴酚藍染料，可在反應結(jié)束后直接進行電泳，使用方便。其中的保護劑使得Mix 經(jīng)過反復凍融后仍可保持穩(wěn)定的活性。PCR產(chǎn)物的3’端帶A，可輕松克隆至T載體。

質(zhì)量控制

核酸外切酶殘留檢測：20μl本品和0.6μg λ-Hind Ⅲ在74 oC下孵育1小時，DNA的電泳譜帶不發(fā)生變化。

核酸內(nèi)切酶殘留檢測：20μl本品和0.6μg Supercoiled pBR322 DNA在74 oC下孵育1小時，DNA的電泳譜帶不發(fā)生變化。

大腸桿菌殘留DNA檢測: 50μl體系中，以ddH2O為模板，擴增E.coil 16s rDNA基因。35個循環(huán)后擴增產(chǎn)物進行1% 瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，無擴增條帶。
功能檢測：50μl體系中，以100ng人基因組DNA為模板擴增dystrophin基因。30個循環(huán)后取10% PCR產(chǎn)物進行1% 瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，觀察到單一的15Kb條帶。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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