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本試劑盒是以分子流行病學新研究進展為基礎，經工藝優化后形成的人型結核分枝桿菌基因分型產品。本產品利用結核分枝桿菌基因組中可發數目串聯重復序列（variable-number tandem repeats,VNTR）多態性進行基因型分型區分臨床菌株，是研究結核分枝桿菌分子流行病學和監測結核病傳播狀況的有力工具。不現有其它基于VNTR原理的結核分枝桿菌VNTR分型系統相比，這一分型系統對中國流行的菌株具有更的分辨能力，因此特別適合于中國用戶的需求。

通過對各PCR反應引物序列和預混反應液成份進行精心優化，使得本試劑盒具有很的抗干擾力。不用戶自配試劑相比，本產品顯著提升了特異條帶信號度，降低了使用粗制模板（煮沸菌液）時非特異條帶的出現率，使實驗操作更加簡便、快捷的同時，提高了檢測成功率。本產品的預混反應液化學穩定性良好，能有效抵抗反復凍融（10次）和較長時間（一周）的室溫環境，更好地適應了用戶檢測工作中的靈活性需求。

本試劑盒將人型結核分枝桿菌（MTBC）鑒定、非結核分枝桿菌（MOTT）及模板質量鑒定、結核分枝桿菌北京家族菌株鑒定，和后續的9位點VNTR分型鑒定整合在一個試劑盒中，使用戶僅需一個試劑盒、12個PCR反應即可獲得待測菌株基因型鑒定所需的完整信息。檢測的分辨力指數（Hunter-Gaston index，HGI）可達0.989。并且，基因型鑒定結果可數字化記錄，使得不同批次樣本，不同地區，不同時間，不同研究者之間的實驗數據可以很方便地進行比對和匯集分析，極大地提高了數據的使用效率。

對鑒定為VNTR-9基因型成簇（所有9個位點具有相同重復數）的樣本，若要判定菌株間是否存在近期傳播關系，需使用配套產品TB基因分型試劑盒HV-3，做進一步的分型鑒定。VNTR-9不HV-3兩個產品的結合使用可將檢測的HGI提升至0.993。關于TB基因分型試劑盒HV-3產品的更多信息請見其產品說明書。
保存：-20℃保存一年

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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