產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔檢測試劑盒(流式分析)	Mitochondrial Permeability Transition Pore Assay Kit ( flow cytometry)	100T	CS-01F96991

線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔，又稱線粒體巨型通道（magachannel），是存在于線粒體內(nèi)外膜之間的非選擇性高導(dǎo)電性通道，由多種蛋白質(zhì)復(fù)合組成。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔 (mPTP)可能參與了細(xì)胞死亡過程中線粒體成分的釋放。

正常的細(xì)胞線粒體內(nèi)膜可維持正常的線粒體電位梯度以保證細(xì)胞呼吸作用及能量供應(yīng)，隨著Ca2+的攝入和釋放，一種低電導(dǎo)滲透性轉(zhuǎn)換孔在張開和閉合中來回切換。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)和病理性死亡時(shí)，線粒體膜電位轉(zhuǎn)換孔滲透性發(fā)生改變，Ca2+的過載，線粒體的氧化，活性氧水平的升高，包括后繼的釋放，線粒體膜電位下降等都會(huì)導(dǎo)致線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔的激活。

線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔檢測試劑盒（流式分析）檢測方法是一種相對于僅基于線粒體膜電位分析更直接的檢測線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放的檢測方法。其原理是：先通過被動(dòng)運(yùn)輸加載Calcein AM，后者是一種對活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑，能夠輕易穿透活細(xì)胞膜，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子 Calcein，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)，使胞質(zhì)包括線粒體發(fā)出綠色熒光。加入CoCl2后，來自胞質(zhì)的熒光被CoCl2淬滅，僅留下線粒體內(nèi)的熒光。作為對照，可將細(xì)胞加載Calcein AM和CoCl2的同時(shí)，對其用離子處理，從而使細(xì)胞加載更多的Ca2+，引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的激活從而使線粒體熒光淬滅。

本試劑盒以1ml標(biāo)記體系計(jì)算，可供100次檢測。檢測大激發(fā)波長494nm，大發(fā)射波長517nm。

產(chǎn)品組份：

Calcein AM———————5×50μg

DMSO——————————250μl

CoCl2(80mM)——————1.2ml

Ionomycin(100μM)————750μl

Cell Stain Buffer———2×250ml
儲(chǔ)存條件：-20℃避光干燥，避免反復(fù)凍融，有效期至少6個(gè)月

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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