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細胞內鈣離子熒光探針(Fluo-4 AM)

  • 產品貨號：CS-01F96987
  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
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  • 含量：25μL
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：細胞內鈣離子熒光探針(Fluo-4 AM)現貨供應，價格實惠。

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標簽:細胞內鈣離子熒光探針(Fluo-4 AM) 25μL 

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細胞內鈣離子熒光探針(Fluo-4 AM)

Intracellular calcium fluorescence probe

25μL

CS-01F96987

Fluo-4 AM是常用的檢測細胞內鈣離子濃度的熒光探針之一，本Fluo-4 AM是配制于無水DMSO中的儲存母液，濃度為2mM。

Fluo-4 AM在Fluo-3 AM的基礎上改進而成，其特點是加載更快并且在相同條件下熒光更加明亮。Fluo-4 AM將Fluo-3 AM結構中的氯原子替換成了氟原子，導致它的大激發波長會向短波長處偏離12nm左右。這個波長更接近于氬激光器的波長488nm，所以用氬激光器激發時，Fluo-4的熒光度會比Fluo-3一倍。由于Fluo-4與鈣離子的親和力和Fluo-3相近，所以使用上和Fluo-3也基本相同，可以使用激光共聚焦顯微鏡、熒光酶標儀等熒光檢測儀器來測定細胞內鈣離子濃度的變化。

用于細胞內鈣離子檢測時，Fluo-4 AM的常用濃度為0.5～5μM。通常用含有0.5～5μM的Fluo-4 AM的適當溶液和細胞一起在20～37℃孵育10～60分鐘進行熒光探針裝載，隨后適當洗滌，洗滌后可以考慮適當再孵育20～30分鐘以確保Fluo-4 AM在細胞內充分轉變成Fluo-4。

基本參數：

分子式：C51H50F2N2O23

分子量：1096.95
保存：-20℃，有效期6個月。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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