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本品是常用的檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的熒光探針之一。用于細(xì)胞內(nèi)鈣離子檢測時，Fura-2 AM的常用濃度為0.5-5μM。通常用含有0.5-5μM的Fura-2 AM的適當(dāng)溶液和細(xì)胞一起在4-37℃孵育15-60分鐘，即可完成熒光探針的裝載。本Fura-2 AM(鈣離子熒光探針)是配制于無水DMSO(anhydrous DMSO)中的儲存液，濃度為2mM。

分子式：C44H47N3O24

分子量：1001.9

Fura-2 AM是一種可以穿透細(xì)胞膜的熒光染料。Fura-2 AM的熒光比較弱，大激發(fā)波長為369nm，大發(fā)射波長為

478nm，并且其熒光不會隨鈣離子濃度改變而改變。Fura-2 AM進(jìn)入細(xì)胞后可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fura-2，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)。Fura-2可以和鈣離子結(jié)合，結(jié)合鈣離子后在330-350nm激發(fā)光下可以產(chǎn)生較的熒光，而在380nm激發(fā)光下則會導(dǎo)致熒光減弱。這樣就可以使用340nm和380nm這兩個熒光的比值來檢測細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度，可以消除不同細(xì)胞樣品間熒光探針裝載效率的差異，熒光探針的滲漏，細(xì)胞厚度差異等一些誤差因素。Fura-2和鈣離子結(jié)合后，大激發(fā)波長為335nm(大激發(fā)波長隨離子濃度的的不同而有所不同)，大發(fā)射波長為505nm。實際檢測時推薦使用的激發(fā)波長為340nm，發(fā)射波長為510nm。如果做雙波長檢測，則推薦使用的激發(fā)波長為340nm和380nm。Fura-2的激發(fā)光譜參考下圖，不同曲線表示不同鈣離子濃度時的激發(fā)光譜。

Fura-2相對而言有較的抗熒光淬滅能力，在熒光顯微鏡或其它熒光檢測設(shè)備上可以連續(xù)檢測1小時而不明顯影響其熒光效果。

注意事項：

1. 本Fura-2 AM在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。

2. 熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
儲存條件：-20℃，有效期6個月。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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