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NadRed紅色核酸染料是一種EB (溴化乙錠)的升級換代產品，用于凝膠中DNA、RNA等核酸的染色。NadRed具有安全(致突變性極低且檢測不到顯著的細胞毒性)、靈敏度高、穩定性好等優點，凝膠中的核酸在使用本產品染色后用適當紫外燈(300nm左右波長)檢測呈現紅色熒光，適用于原先使用EB為染料的凝膠成像系統。

NadRed比EB和SYBR Green更安全。NadRed在遠高于其工作濃度范圍時均沒有細胞毒性及誘變性。艾姆斯氏試驗(Ames test)結果表明，NadRed的誘變性遠小于EB。EB在多種致突變測試中呈現很的誘變性，而NadRed僅僅在濃度高達20微克/毫升時，并在S9代謝活化時有非常微弱的誘變性。通常NadRed在凝膠中的工作濃度約為2微克/毫升，大大低于可導致誘變的濃度。NadRed和的另外一種安全型核酸染料NadGreen，由于它們特殊的化學結構使其難以進入細胞，從而大大降低甚至避免了染料的致突變性和細胞毒性。而SYBR Green染料可以穿透細胞膜，進入活細胞并染色DNA，并且有報道SYBR Green可以烈增紫外線誘導的基因突變。

NadRed的使用方法和EB一致。NadRed可以按適當比例直接加入瓊脂糖中配制成凝膠，也可以在電泳完畢后對凝膠進行染色。前者更加方便，而后者靈敏度要更高一些。但由于NadRed本身已經非常靈敏，通常采用把NadRed直接配制在凝膠中就可以了。對于一些特殊情況，如核酸樣品量特別少的情況等，則可以考慮電泳后再對凝膠進行染色。

本制品可室溫保存，至少兩年有效。

NadRed對于核酸的遷移率影響非常小，小于SYBR Green對于核酸遷移率的影響。

通過凝膠回收試劑盒或酚氯仿抽提，可以有效去除與DNA或RNA結合的NadRed，從而確保不會影響后續的連接、酶切、PCR、測序等常規的分子生物學用途。

注意事項：

制備好的NadRed瓊脂糖凝膠，在4℃避光條件下通常可以保存3-5天。

NadRed瓊脂糖凝膠再次熔化使用時，為取得更好的觀察效果，需要添加適量NadRed。

電泳之后的凝膠不建議重復使用。

電泳后再使用NadRed染色的凝膠一般不需要脫色。如果發現背景太高，可以使用不含核酸酶的水進行脫色處理。

NadRed和NadGreen除了可以染色雙鏈DNA外，也可染色單鏈DNA和RNA。NadRed對單鏈核酸的染色靈敏度約為對雙鏈DNA染色靈敏度的一半。NadRed對單鏈核酸的染色靈敏度約為NadGreen的5倍。

如果使用聚丙烯酰胺凝膠，請使用浸泡染色法染膠，并延長染色時間至30分鐘-1小時。

如果觀察到條帶彌散或者分離不理想，建議使用浸泡染色法染色以確認是否與染料有關。如果浸泡染色法染色后仍然出現類似的問題，說明與染料無關，請嘗試以下方法：使用新鮮配制的電泳緩沖液、降低核酸的上樣量、降低染料的濃度、降低瓊脂糖濃度、選用更長的凝膠、降低電泳電壓一倍以上并延長凝膠電泳時間以改善電泳效果、使用更薄的梳齒等。

本產品兼容常用的電泳緩沖液，例如TAE和TBE。
NadRed不屬于有毒有害物質，并通過了環境安全相關測試，相關廢棄物無需特殊處理，可以參考常規化學試劑進行處理。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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