產(chǎn)品目錄

本產(chǎn)品是由λDNA經(jīng)HindIII和EcoRI完全雙酶切而成，適用于瓊脂糖凝膠電泳中DNA條帶的分析。產(chǎn)品濃度為0.1μg/μl，已含有1×loading buffer，可直接取2-5μl上樣，使用方便。12條帶的大小分別為564，831，947，1375，1584，1904，2027，3530，4268，4973，5148，21226bp。

使用方法：

1.65℃加熱5分鐘，立即冰浴3分鐘，取2-5μl本產(chǎn)品加入到瓊脂糖凝膠的加樣孔中就行電泳。

注：根據(jù)梳子的厚度和寬度進(jìn)行上樣。每1mm×1mm(厚度×寬度)加樣孔上樣1μl。窄齒梳子(一般為1mm×2mm)上樣2μl；寬齒梳子(一般為1mm×5mm)上樣5μl。如果使用厚齒梳子或?qū)捰?/span>5mm的梳子，可以適當(dāng)調(diào)整上樣量。

2. 建議電泳條件：凝膠濃度為1.0％，凝膠長(zhǎng)度8-10cm，電泳電壓4-10v/cm，電泳時(shí)間45分鐘。

3. 通過(guò)EB染色后紫外燈下觀察條帶。

注意事項(xiàng)：

1. λ DNA酶切Marker的末端容易由COS末端結(jié)合在一起，電泳前65℃預(yù)熱5分鐘能解開(kāi)結(jié)合的COS末端，得到更清晰的電泳圖像。如果不預(yù)熱，21226bp和3530bp會(huì)結(jié)合形成24756bp的額外片段，同時(shí)電泳后3530bp亮度會(huì)明顯弱于其他片段。

2. 瓊脂糖的質(zhì)量對(duì)DNA的電泳有很大影響，電泳時(shí)請(qǐng)盡量使用質(zhì)量?jī)?yōu)等的瓊脂糖。

3. 請(qǐng)使用新鮮配制的電泳緩沖液和新鮮配制的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以保證Marker良好的分離效果。
儲(chǔ)存條件：-20℃，有效期1年。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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