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GoldView是一種可替代溴化乙錠（EB）的新型核酸染料，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 時(shí)，其與DNA發(fā)生結(jié)合并產(chǎn)生很的熒光信號(hào)，靈敏度與 EB 相當(dāng)，使用方法與之完全相同。在紫外透射光下雙鏈DNA呈現(xiàn)綠色熒光，而單鏈DNA呈現(xiàn)紅色熒光。GoldView特別適合大片段（＞1 kb）DNA的檢測(cè)，靈敏度高。也可用于RNA的染色。

使用方法

1）將100 ml瓊脂糖凝膠溶液（濃度一般為0.8%-2%）在微波爐中融化。

2）加入5-10 μl GoldView（若背景過高可以適當(dāng)減少用量；若靈敏度過低，可以適當(dāng)增加用量），輕輕搖勻，避免產(chǎn)生氣泡。

3）冷卻至不燙手時(shí)倒膠，待瓊脂糖凝膠完全凝固后上樣電泳。

4）電泳完畢，使用凝膠成像系統(tǒng)或可見光透射儀觀測(cè)。注：若使用凝膠成像系統(tǒng)照相時(shí)，通過調(diào)節(jié)光圈、曝光時(shí)間選擇合適的濾光片，可得到成像清晰、背景較低的照片。

注意事項(xiàng)

1）膠厚度不宜過0.5cm，膠太厚會(huì)影響檢測(cè)的靈敏度。

2）加入GoldView的瓊脂糖凝膠反復(fù)融化可能會(huì)對(duì)核酸檢測(cè)的靈敏度產(chǎn)生一定影響。

3） GoldView特別適用于大片段（＞1 kb）DNA的檢測(cè)。對(duì)于更小片段的DNA，特別是＜500bp檢測(cè)信號(hào)可能很弱或者無(wú)信號(hào)。對(duì)于＜500bp的DNA染色，建議使用SYBR Green I 核酸染料。

4）含GoldView的凝膠不適合進(jìn)行膠回收實(shí)驗(yàn)。

5） Goldview的主要成分是吖啶橙，具有細(xì)胞滲透性，有一定的細(xì)胞毒性。建議操作人員使用時(shí)做好防護(hù)措施，帶上手套和口罩。并妥善處理好廢棄物。

6）另提供無(wú)毒的EB替代物-Dured核酸染料（SY0244），烈推薦使用。

7）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
儲(chǔ)存條件：RT。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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