產(chǎn)品目錄

目前常見的替代EB的核酸染料SYBR Green I(屬于花氰類染料)雖然毒性比EB低、靈敏度比EB高，但由于其化學(xué)穩(wěn)定性差(怕光、怕水、怕熱)，實驗結(jié)果的重復(fù)性往往不盡人意；此外，SYBR Green I在電泳過程中能在DNA分子間移位，很容易使DNA 條帶模糊和扭曲，電泳清晰度和分辨率也不如EB。所以在實際應(yīng)用中依然不能有效替代EB。本產(chǎn)品是同時具有EB 穩(wěn)定性和SYBR Green I低毒性的新性核酸染料

產(chǎn)品特點：

1.低毒。其主要成分未發(fā)現(xiàn)對人體有致癌性、未被列入有毒有害品，有利于保護使用者的健康和保護日益惡化的環(huán)境。

2. 靈敏。檢測靈敏度跟EB相當(dāng)，能滿足常規(guī)核酸電泳實驗要求。

3. 穩(wěn)定。對光、水和熱的穩(wěn)定性跟EB相當(dāng)，可加入瓊脂糖凝膠中反復(fù)熔化。

4. 無分子間位移現(xiàn)象。不會出現(xiàn)SYBR染料常見的條帶模糊和扭曲現(xiàn)象。

5. 使用方法多樣。既可以加入熔化的膠中，也可以電泳后染色，還可用于PAGE。

6.跟各種常用的核酸電泳緩沖液(如SuperBuffer-2、TBE、TAE)兼容，但在SuperBuffer-2和TBE中背景低。

7. 觀察時不需要任何額外的儀器設(shè)備或UV光源，可以使用現(xiàn)成的觀察EB的300nm UV。

8.可用于RNA染色(也呈綠色)。

9. DNA或RNA濃度較高時還可以直接在日光下觀察(需要將膠放在黑色背景下)。由于避免了UV 對DNA的傷害，尤其適用于膠回收實驗。

儲存條件：常溫運輸，4℃保存，有效期一年。
使用方法：
注意:雖然本產(chǎn)品的主要成分未發(fā)現(xiàn)對人體有致癌性、未被列入有毒有害品，但操作時好還是戴上塑料手套。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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