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本試劑盒操作簡單快速、提取量高。整個提取過程不過10分鐘，不需要離心收集細菌和重懸菌體，直接在培養好的菌液中加入獨特的裂解液Buffer L2，隨后中和、離心過柱，提取出的質粒可高達30μg，并大限度去除蛋白質、基因組等其它雜質。提取出的質粒DNA可直接用于細菌轉化、酶切、PCR、體外轉錄、測序等其它下游實驗。

保存條件：室溫(15～30℃)

自備試劑：無水乙醇。

實驗前準備及重要注意事項：

本試劑盒可在干燥、室溫（15～30℃）環境下保存1年，如需保存更長時間可將離心柱置于2～8℃。

次使用前，將RNase A溶液全部加入到Buffer N3中，混勻，置于2～8℃保存。

次使用前應按照試劑瓶標簽的說明在Buffer PW中加入無水乙醇。

使用前若Buffer L2有沉淀，請置于37℃水浴中不斷混勻直至溶液變澄清方可使用。

操作步驟：

取600μL細菌培養液到1.5mL離心管(自備)中。

向上述離心管中加入100μL Buffer L2，溫和地上下顛倒溶液8次，溶液應由渾濁變為澄清的紫色，表明裂解完全。裂解時間不應過2分鐘。

向上述離心管中加入350μL Buffer N3(請先檢查是否已加入RNaseA)，立即上下顛倒約8～10次充分混勻，此時溶液應完全變為黃色并有黃色沉淀形成。13000rpm離心2～3分鐘。

將步驟3中所得上清液緩慢倒入已備好的吸附柱吸附柱DM中，避免沉淀進入吸附柱。

13000rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

向吸附柱中加入150μL Buffer PB，13000rpm離心15秒。

向吸附柱中加入400μL Buffer PW(請先檢查是否已加入無水乙醇)，13000rpm離心1分鐘。

將吸附柱置于一個新的離心管(自備)中，向吸附膜的中間部位加入30～100μL Buffer EB，13000rpm離心1分鐘，收集質粒DNA,-20℃長期保存。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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