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產品名稱	英文名稱	規格	貨號
柱式質粒DNA小量抽提試劑盒(1.5～5mL)	SgPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit(1.5-5mL)	50次\|100次	CS-01F96639

本試劑盒采用了一種新型的吸附材料，新吸附柱擁有良好的流速、的DNA結合能力和優秀的洗脫效率。改良的配方使試劑盒的菌液裂解能力、DNA與吸附柱的結合能力大大加，新型裂解染料Visualysis的加入讓裂解過程變得可視、可控，實現質粒得率大化。對于高拷貝質粒，從6mL過夜菌液（OD600=2.0）中可以獲得過35μg的質粒DNA。操作過程快速、方便，無需使用酚/氯仿抽提，無需乙醇沉淀，整個抽提過程可以在20分鐘內完成。由本試劑盒抽提得到的質粒純度高，OD260/OD280比值一般在1.8～1.9之間，OD260/OD230比值大于2.0，可直接用于轉化、DNA測序、PCR、基于PCR的突變、體外轉錄、酶切等后續實驗。

試劑盒特點：

使用新型吸附柱材料，吸附容量大，洗脫效率高。

新型裂解染料Visualysis讓裂解過程可視化，實現質粒得率大化。

操作過程快速、方便，無需使用酚/氯仿抽提，無需乙醇沉淀，全過程可在30分鐘內完成。

保存：常溫（18～25℃），RNase A收到后，請及時置于2～8℃保存，長期貯存請于-20℃放置。

注意：

加入RNase A后，Buffer P1請存放于2～8℃，有效期為半年。其他組分可于室溫存放—年，長期存放請置于2～8℃。

Buffer P3和去蛋白液DW1中含有刺激性的化合物，操作過程中應穿上實驗服，戴好乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和衣服，防止吸入口鼻。沾染皮膚或眼睛后，請立即用清水或生理鹽水沖洗，必要時尋求醫生的幫助。

快速操作流程：

準備工作。

□ 檢查Buffer P1中是否已經加入RNase A。

□ 檢查洗滌液WB中是否已經加入無水乙醇。

□ 檢查Buffer P2和P3是否出現沉淀。

取1.5～5mL過夜培養的菌液，8000g離心2分鐘收集菌體，棄盡培養基。

在沉淀中加入250μL Buffer P1，徹底懸浮菌體。

加入250μL Buffer P2，立即溫和顛倒離心管5～10次混勻。室溫靜置2～4分鐘。

加入350μL Buffer P3，立即溫和顛倒離心管5～10次混勻。

12000g離心5～10分鐘。將上清液移入吸附柱，8000g離心30秒，倒掉收集管中液體。

(選做）加入500μL去蛋白液DW1，9000g離心30秒，倒掉收集管中液體。

加入500μL洗滌液WB，9000g離心30秒，倒掉收集管中液體。

重復步驟8一次

空吸附柱9000g離心1分鐘。

將吸附柱放入—個干凈的1.5mL離心管中，在吸附膜中央加入50～100μL洗脫液EB，室溫靜置1分鐘后，離心1分鐘。保存管中DNA溶液。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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