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本試劑盒采用了一種新型的離子交換柱，在特定條件下，使質(zhì)粒能在離心過(guò)柱的瞬間結(jié)合到質(zhì)粒純化柱上，在一定條件下又能將質(zhì)粒充分洗脫，從而實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒的快速純化。該質(zhì)粒提取試劑盒采用改進(jìn)的質(zhì)粒抽提系統(tǒng)，徹底解決了RNA污染的問(wèn)題。新型的離子交換柱具有高達(dá)40μg的結(jié)合能力，每個(gè)純化柱可用于抽提1～5mL LB培養(yǎng)過(guò)夜的大腸桿菌菌液，抽提所得的質(zhì)粒的OD值一般在1.80左右。由本試劑盒抽提所得的質(zhì)粒可直接用于轉(zhuǎn)化、DNA測(cè)序、PCR、基于PCR的突變、體外轉(zhuǎn)錄、酶切等。

保存條件：室溫避光保存，有效期2年。(RNase A置于-20℃保存)

注意事項(xiàng)：

使用Washing Buffer(洗滌液)時(shí)應(yīng)加入80mL無(wú)水乙醇并混勻，請(qǐng)及時(shí)做好標(biāo)記，使用Buffer A時(shí)應(yīng)加入0.5mL的RNase A并做好標(biāo)記。

如Buffer B出現(xiàn)沉淀，可50℃加熱處理至沉淀溶解后仍可使用，不影響試驗(yàn)結(jié)果。

操作方法：

取過(guò)夜培養(yǎng)的菌液1.8mL加入到2mL EP管中，13000rpm室溫離心1min后收集細(xì)菌沉淀。倒掉上清液，可再次加入菌液1.8mL，離心后去除上清液。

每管加入250μL Buffer A（確認(rèn)已經(jīng)加入RNase A），用吸頭吹打沉淀菌體至無(wú)可見細(xì)菌團(tuán)塊，以確保沉淀完全散開。

每管加入250μL Buffer B，輕輕顛倒離心管4～6次，室溫放置2分鐘，使細(xì)菌完全裂解，溶液應(yīng)變的透明。切勿劇烈振蕩，否則會(huì)導(dǎo)致基因組DNA斷裂，從而導(dǎo)致所得質(zhì)粒被基因組DNA污染。

每管加入350μL Buffer C，隨即顛倒離心管4～6次混勻(切勿劇烈振蕩)，可見白色絮狀物產(chǎn)生，室溫靜置1min。

手腕用力上下振蕩4～6次，使白色絮狀物振散，然后置于離心機(jī)上13000rpm室溫離心10min。

將上一步驟離心后的上清倒入或吸入到質(zhì)粒純化柱內(nèi)，13000rpm離心30s，倒棄收集管內(nèi)液體。(切勿吸入白色沉淀，否則會(huì)堵塞離心柱)。

在質(zhì)粒純化柱內(nèi)加入500μL Washing Buffer(務(wù)必確認(rèn)已加入無(wú)水乙醇)，13000rpm室溫離心30s，洗去雜質(zhì)，倒棄收集管內(nèi)液體。

重復(fù)步驟7一次。

將吸附柱重新放入套管中，13000rpm室溫空離心2min。

將質(zhì)粒純化柱置于新的1.5mL離心管上，靜置2min，使痕量乙醇完全揮發(fā)，加入80～120μL Elution Buffer至管內(nèi)柱面上，放置1min。Elution Buffer使用前好50℃水浴預(yù)熱。

13000rpm室溫離心2min，所得液體即為高純度質(zhì)粒。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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