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本試劑盒采用堿裂解法裂解細胞，通過離心吸附柱在高鹽狀態下特異性地結合溶液中的DNA。離心吸附柱中采用的硅基質材料為本公司新型材料，高效、專一吸附DNA，可去除雜質蛋白及細胞中其他有機化合物。以下操作步驟適用于提取5～15mL過夜培養的大腸桿菌，質粒提取得率和質量與宿主菌的種類和培養條件，細胞的裂解，質?？截悢?，質粒的穩定性，抗生素等因素有關。

本試劑盒提取的質粒DNA可適用于各種常規操作，包括酶切、PCR、測序、連接、轉化、文庫篩選、體外翻譯、轉染一些常規的傳代細胞等。

產品特點：

快速：步驟少，操作簡單，節省時間。

高效：可提取菌體85%以上質粒DNA。

保存條件：室溫（15～25℃)干燥條件下，可保存12個月，更長時間的保存可置于

2～8℃。2～8℃保存條件下，若溶液產生沉淀，使用前應將試劑盒內的溶液在室溫放置一段時間，必要時可在37℃水浴中預熱10min，以溶解沉淀。次使用前將RNase A加入溶液P1中，混勻后置于2～8℃保存，可穩定保存12個月以上。單獨包裝的RNase A在室溫可穩定保存12個月以上。

注意事項：（請務必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項)

溶液P1在使用前先加入RNase A（將試劑盒中提供的RNase A全部加入），混勻，置于2～8℃保存。

使用前先檢查平衡液BL、溶液P2和P3是否出現渾濁，如有混濁現象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，即可恢復澄清。

注意不要直接接觸溶液P2和P3，使用后應立即蓋緊蓋子。

所有離心步驟均為使用臺式離心機室溫下進行離心，速度為12000rpm （~13400×g)。

提取的質粒量與細菌培養濃度、質粒拷貝數等因素有關。如果所提質粒為低拷貝質?；虼笥?/span>10kb的大質粒，應加大菌體使用量，同時按比例增加P1、P2、P3的用量，洗脫緩沖液應在65～70℃預熱。可以適當的延長吸附和洗脫的時間，以增加提取效率。

實驗前使用平衡液處理吸附柱，可以大限度激活硅基質膜，提高得率。

用平衡液處理過的柱子好當天使用，放置時間過長會影響效果。

去蛋白液PD可以有效去除殘留的蛋白雜質，當宿主菌為endA+（TG1、BL21、HB101、ET1256、JM101等）核酸酶含量較高的菌株時，烈推薦使用去蛋白液PD。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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