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本試劑盒用堿裂解法從培養(yǎng)菌中提取質粒DNA，采用獨特的溶液配方和內毒素清除試劑，只需要幾次簡單離心去除蛋白質、多糖、內毒素、RNA等雜質，獲得高質量的質粒DNA。純化DNA的OD260/280通常在1.8左右，得到的質粒可直接應用于細胞轉染甚至動物體內實驗等對DNA純度要求很高的工作中。純化后期過程均在1.5mL小離心管中操作，方法簡單，不需特殊設備，無需過柱，不用酚氯仿抽提；基本可完全回收細菌裂解釋放出的質粒，不必擔心質粒DNA的丟失。本方法提取純化質粒DNA，對質粒損傷小，即使是10kb甚至100kb以上的大型質粒或大型BAC/PAC質粒，只要堿裂解法能夠提取，就可以有效純化。可選擇任意小體積溶解質粒，濃度可高達5μg/μl。螺旋比例可高達95%，無內毒素，轉染效果好。

試劑盒特點：

不需要使用有毒的，氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀。快速、方便、從50～70mL大腸桿菌LB((Luria-Bertani)培養(yǎng)液中，可快速提取100～250μg純凈的高拷貝質粒DNA，提取率達80～90%。

獲得的質粒產量高，濃度高，螺旋比例高，純度好，可直接用于酶切、轉化、PCR、體外轉錄、測序等各種分子生物學實驗。

內毒素含量極低（<0.1 EU/μg DNA），可直接應用于細胞轉染。

保存：室溫儲存12個月不影響使用效果。

保存事項：

次使用時，將試劑盒所帶全部的RNase A加入溶液P1后（終濃度100μg/ml）置于4℃保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的質粒可能會混雜有微量RNA殘留，在溶液P1中補加RNase A即可。

內毒素清除劑在4℃可保存一個月，如果要長期保存，建議保存在-20℃!

環(huán)境溫度低時溶液P2中SDS可能會析出出現(xiàn)渾濁或者沉淀，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復澄清，不要劇烈搖晃，以免形成過量的泡沫。

避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。

注意事項：

提取的質粒量與細菌培養(yǎng)濃度、質粒拷貝數(shù)等因素有關。如果所提質粒為低拷貝質粒或大于10kb的大質粒，應加大菌體使用量，同時按比例增加P1、P2、PⅢ的用量。

提取大質粒時操作動作要輕柔，應該使用剪大了開口的吸頭，防止機械剪切對DNA的損壞。

DNA沉淀液沉淀離心后，可能看不到明顯沉淀。如未見沉淀，擔心DNA丟失，可保留上清液，待完成全部操作后電泳鑒定，以確定是否獲得終產物（數(shù)百微克DNA離心沉淀在管的側壁上，可能無法看到明顯團塊）。

得到的質粒DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。OD260值為1相當于大約50μg/ml DNA。電泳可能為單一條帶，也可能為2條或者多條DNA條帶，這主要是不同程度的螺旋構象質粒泳動位置不一造成，與提取物培養(yǎng)時間長短、提取時操作劇烈程度等有關。本公司產品正常操作情況下基本螺旋可以過95%。

質粒DNA確切分子大小，必須酶切線性化后，對比DNA分子量Marker才可以知道。處于環(huán)狀或者螺旋狀態(tài)的質粒，泳動位置不確定，無法通過電泳知道確切大小。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術有限公司

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