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標(biāo)簽:質(zhì)粒大量提取試劑盒(150~300mL ) 10次
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人增殖誘導(dǎo)配體酶聯(lián)免疫試劑盒實(shí)驗(yàn)技術(shù)
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產(chǎn)品名稱 | 英文名稱 | 規(guī)格 | 貨號(hào) |
質(zhì)粒大量提取試劑盒(150~300mL ) | Plasmid Maxi Kit(150-300mL ) | 10次 | CS-01F96589 |
本試劑盒采用改進(jìn)SDS-堿裂解法裂解細(xì)胞,離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽、低pH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA,再通過去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除,后低鹽、高pH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。
試劑盒特點(diǎn): 離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進(jìn)口世界著名公司特制吸附膜,柱與柱之間吸附量差異極小,可重復(fù)性好。克服了國產(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。 不需要使用有毒的、氯仿等試劑,也不需要乙醇沉淀。快速、方便,從150~300mL大腸桿菌LB((Luria-Bertani)培養(yǎng)液中,可快速提取0.5~2mg純凈的高拷貝質(zhì)粒DNA,提取率達(dá)80%以上。 獲得的質(zhì)粒產(chǎn)量高、螺旋比例高、純度好,可以直接用于酶切、轉(zhuǎn)化、PCR、體外轉(zhuǎn)錄、測序等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。 保存:室溫儲(chǔ)存12個(gè)月不影響使用效果。 保存事項(xiàng): 次使用時(shí),將試劑盒所帶全部的RNase A加入溶液P1后(終濃度100μg/ml)置于4℃保存。如果溶液P1中RNase A失活,提取的質(zhì)??赡軙?huì)有微量RNA殘留,在溶液P1中補(bǔ)加RNase A即可。 環(huán)境溫度低時(shí)溶液P2中SDS可能會(huì)析出出現(xiàn)渾濁或者沉淀,可在37℃水浴加熱幾分鐘,即可恢復(fù)澄清,不要?jiǎng)×覔u晃,以免形成過量的泡沫。 避免試劑長時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH值變化,各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子。 操作步驟:(實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先閱讀注意事項(xiàng)) 提示: ① 次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB瓶中加入量無水乙醇,充分混勻,加入后請(qǐng)及時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇,以免多次加入! ② 將RNase A全部加入溶液P1中,混勻。每次使用后置于2~8℃保存。 取150~200mL (多不過300mL)過夜培養(yǎng)的菌液,12000×g(約10000rpm),離心1~2分鐘,盡可能的倒干上清,收集菌體。 收集過50毫升菌液,可以離心棄上清后,在同一個(gè)50mL管內(nèi)加入更多的菌液,重復(fù)步驟1,直到收集到足夠的菌體。 用7.5mL溶液P1重懸菌體沉淀,移液器吹打或者渦旋振蕩至徹底懸浮。 如果有未徹底混勻的菌塊,會(huì)影響裂解,導(dǎo)致提取量和純度偏低。 加7.5mL的溶液P2,溫和地上下翻轉(zhuǎn)6~8次使菌體充分裂解,室溫放置4~5分鐘。 溫和地混合,不要?jiǎng)×艺鹗?,以免基因組DNA剪切斷裂!所用時(shí)間不應(yīng)過5分鐘!以免質(zhì)粒受到破壞。此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠。如果很渾濁,可能由于菌體過多,裂解不徹底,應(yīng)減少菌體量。 加7.5mL溶液N3,立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6~8次,充分混勻此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000×g離心10~15分鐘,小心取上清至新管,避免吸取到漂浮的白色沉淀。 加入溶液N3后應(yīng)該立即混勻,以免產(chǎn)生SDS的局部沉淀。 向上清中加入0.5體積異丙醇(約10mL)后充分顛倒混勻后分多次(每次不過15mL)轉(zhuǎn)入吸附柱DC中(吸附柱放入收集管中),12000×g離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液。直到所有混合溶液通過此吸附柱。 加入10mL漂洗液WB(請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇!),12000×g離心1分鐘,棄掉廢液。再加入10mL漂洗液WB,重復(fù)漂洗一次。 將吸附柱DC放回空收集管中,高速(好大于12000×g)離心2分鐘以干燥基質(zhì)膜上殘留乙醇。 該步驟為徹底去除吸附柱中殘留乙醇,殘留乙醇抑制下游反應(yīng)并且嚴(yán)重降低洗脫效率,降低質(zhì)粒產(chǎn)量。 取出吸附柱DC,放入一個(gè)干凈的離心管中,在吸附膜的中間部位加1~2mL洗脫緩沖液EB(洗脫緩沖液事先在65~70℃水浴中預(yù)熱可提高產(chǎn)量),室溫放置2分鐘,12000×g離心1~2分鐘。 推薦:為了增加質(zhì)粒的回收效率,可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中,室溫放置1分鐘,12000×g離心1~2分鐘。洗脫兩遍可提高濃度約10%。
洗脫體積越大,洗脫效率越高,如果需要質(zhì)粒濃度較高,可以適當(dāng)減少洗脫體積,但是需注意體積過小降低質(zhì)粒洗脫效率,減少質(zhì)粒產(chǎn)量(小不應(yīng)少于1mL)。 |
原創(chuàng)作者:上海莼試生物技術(shù)有限公司
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