產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
高純度質(zhì)粒大量提取試劑盒(100～300mL)	HighPure Plasmid Maxi Kit(100-300mL)	10次	CS-01F96588

本試劑盒采用改進(jìn)SDS-堿裂解法裂解細(xì)胞，離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽、低pH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除，后低鹽、高pH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

試劑盒特點(diǎn)：

離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進(jìn)口世界著名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復(fù)性好。克服了國產(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。

不需要使用有毒的、氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀。快速、方便，從100～300mL大腸桿菌LB((Luria-Bertani)培養(yǎng)液中，可快速提取0.5～2mg純凈的高拷貝質(zhì)粒DNA，提取率達(dá)80%以上。

獲得的質(zhì)粒產(chǎn)量高、螺旋比例高、純度好，可以直接用于酶切、轉(zhuǎn)化、PCR、體外轉(zhuǎn)錄、測序等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

保存：室溫儲存12個月不影響使用效果。

保存事項：

次使用時，將試劑盒所帶全部的RNase A加入溶液P1后（終濃度100μg/ml）置于4℃保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的質(zhì)粒可能會有微量RNA殘留，在溶液P1中補(bǔ)加RNase A即可。

環(huán)境溫度低時溶液P2中SDS可能會析出出現(xiàn)渾濁或者沉淀，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清，不要劇烈搖晃，以免形成過量的泡沫。

避免試劑長時間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時蓋緊蓋子。

操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請先閱讀注意事項）

提示：

① 次使用前請先在漂洗液WB瓶和去蛋白液PE瓶中加入量無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!

② 將RNase A全部加入溶液P1中，混勻。每次使用后置于2～8℃保存。

取150～200mL (多不過300mL)過夜培養(yǎng)的菌液，12000×g（約10000rpm），離心1～2分鐘，盡可能的倒干上清，收集菌體。

收集過50毫升菌液，可以離心棄上清后，在同一個50mL管內(nèi)加入更多的菌液，重復(fù)步驟1，直到收集到足夠的菌體。

用7.5mL溶液P1重懸菌體沉淀，移液器吹打或者渦旋振蕩至徹底懸浮。

如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。

加7.5mL的溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次使菌體充分裂解，室溫放置4～5分鐘。

溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免基因組DNA剪切斷裂！所用時間不應(yīng)過5分鐘！以免質(zhì)粒受到破壞。此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠。如果很渾濁，可能由于菌體過多，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。

加7.5mL溶液N3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次，充分混勻此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000×g離心10～15分鐘，小心取上清至新管，避免吸取到漂浮的白色沉淀。

加入溶液N3后應(yīng)該立即混勻，以免產(chǎn)生SDS的局部沉淀。

向上清中加入0.5體積異丙醇（約10mL）后充分顛倒混勻后分多次（每次不過15mL）轉(zhuǎn)入吸附柱DC中（吸附柱放入收集管中），12000×g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。直到所有混合溶液通過此吸附柱。

加入10mL去蛋白液PE（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12000×g離心1分鐘，棄掉廢液。

此步驟為了去除痕量核酸酶等雜質(zhì)，如所用菌株為JM系列、HB101等endA菌

株或野生型菌株，核酸酶含量豐富，應(yīng)加此步驟；如所用菌株為XL-1 Blue、0和DH5α等缺陷型菌株，核酸酶含量低，則可略過此步驟。

加入10mL漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12000×g離心1分鐘，棄掉廢液。再加入10mL漂洗液WB，重復(fù)漂洗一次。

將吸附柱DC放回空收集管中，高速（好大于12000×g）離心2分鐘以干燥基質(zhì)膜上殘留乙醇。

該步驟為徹底去除吸附柱中殘留乙醇，殘留乙醇抑制下游反應(yīng)并且嚴(yán)重降低洗脫效率，降低質(zhì)粒產(chǎn)量。

取出吸附柱DC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加1～2mL洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在65～70℃水浴中預(yù)熱可提高產(chǎn)量），室溫放置2分鐘，12000×g離心1～2分鐘。

推薦：為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置1分鐘，12000×g離心1～2分鐘。洗脫兩遍可提高濃度約10%。

洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要質(zhì)粒濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積，但是需注意體積過小降低質(zhì)粒洗脫效率，減少質(zhì)粒產(chǎn)量（小不應(yīng)少于1mL）。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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