產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
大型質(zhì)粒大量提取試劑盒(150～200mL)	PhasePrep EndoFree Plasmid Maxi Kit(150-200mL)	20次	CS-01F96586

本試劑盒用堿裂解法從培養(yǎng)菌中提取質(zhì)粒DNA，采用獨(dú)特的溶液配方和內(nèi)毒素清除試劑，只需要幾次簡單離心去除蛋白質(zhì)、多糖、內(nèi)毒素、RNA等雜質(zhì)，獲得高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA。純化DNA的OD260/OD280通常在1.8左右，得到的質(zhì)粒可直接應(yīng)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染甚至動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等對(duì)DNA純度要求很高的工作中。純化后期過程均在Eppendorf管中操作，方法簡單，不需特殊設(shè)備，無需過柱，不用酚氯仿抽提；基本可完全回收細(xì)菌裂解釋放出的質(zhì)粒，不必?fù)?dān)心質(zhì)粒DNA的丟失。本方法提取純化質(zhì)粒DNA，對(duì)質(zhì)粒損傷小，即使是10kb甚至100kb以上的大型質(zhì)粒或大型BAC/PAC質(zhì)粒，只要堿裂解法能夠提取，就可以有效純化。可選擇任意小體積溶解質(zhì)粒，濃度可高達(dá)3μg/μl。

試劑盒特點(diǎn)：

不需要使用有毒的，氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀。快速、方便、從150～200mL大腸桿菌LB((Luria-Bertani)培養(yǎng)液中，可快速提取0.4～1mg純凈的高拷貝質(zhì)粒DNA，提取率達(dá)80～90%。

獲得的質(zhì)粒產(chǎn)量高，螺旋比例高，純度好，可直接用于酶切、轉(zhuǎn)化、PCR、體外轉(zhuǎn)錄、測序等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

內(nèi)毒素含量極低（＜0.1 EU/μg DNA），可直接應(yīng)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

保存：室溫儲(chǔ)存18個(gè)月不影響使用效果。

保存事項(xiàng)：

次使用時(shí)，將試劑盒所帶全部的RNase A加入溶液P1后（終濃度100μg/ml）置于4℃保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的質(zhì)粒可能會(huì)混雜有微量RNA殘留，在溶液P1中補(bǔ)加RNase A即可。

內(nèi)毒素清除劑在4℃可保存一個(gè)月，如果要長期保存，建議保存在-20℃!

環(huán)境溫度低時(shí)溶液P2中SDS可能會(huì)析出出現(xiàn)渾濁或者沉淀，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清，不要?jiǎng)×覔u晃，以免形成過量的泡沫。

避免試劑長時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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