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高純酵母質粒大量提取試劑盒(100~180mL)

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  • 產品產地:國產
  • 包裝類型:盒裝
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  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容:高純酵母質粒大量提取試劑盒(100~180mL)現貨供應,價格實惠。

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高純酵母質粒大量提取試劑盒(100180mL)

Yeast Plasmid Maxi Kit(100-180mL)

10

CS-01F96585

本試劑盒采用改進SDS-堿裂解法裂解細胞并結合破壁酶特異消化酵母細胞壁,能在1小時內從酵母培養液中分離出高純度質粒DNA。酵母收集后,加入破壁酶去除細胞壁后,然后堿裂法裂解細胞,離心吸附柱內的硅基質膜在高鹽、低PH值狀態下選擇性地結合溶液中的質粒DNA,再通過去蛋白液和漂洗液將雜質和其它細菌成分去除,后低鹽、高PH值的洗脫緩沖液將純凈質粒DNA從硅基質膜上洗脫。

試劑盒特點:

離心吸附柱內硅基質膜全部采用進口世界著名公司特制吸附膜,柱與柱之間吸附量差異極小,可重復性好。克服了國產試劑盒膜質量不穩定的弊端。

快速、方便,不需要使用有毒的、氯仿等試劑,也不需要乙醇沉淀。獲得的質粒產量高、純度好,可以直接用于酶切、轉化、PCR、體外轉錄、測序等各種分子生物學實驗。

保存:室溫儲存12個月不影響使用效果。

保存事項:

次使用時,將試劑盒所帶的全部RNaseA加入溶液YP1(終濃度100μg/ml)置于4℃保存。如果溶液YP1RNase A失活,提取的質??赡軙形⒘?/span>RNA殘留,在溶液YP1中補加RNase A即可。

環境溫度低時溶液YP2SDS可能會析出渾濁或者沉淀,可在37℃水浴加熱幾分鐘,即可恢復澄清,不要劇烈搖晃,以免形成過量的泡沫。

避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發、氧化、pH值變化,各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。

操作步驟:(實驗前請先閱讀注意事項)

提示:

次使用前請先在漂洗液WB瓶中加入量無水乙醇,充分混勻,加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇,以免多次加入!

RNase A全部加入溶液P1中,混勻。每次使用后置于28℃保存。

將溶液P3放在冰上預冷。

吸取使用量的Sorbitol buffer加入0.1%β-巰基乙醇,回復到室溫備用。

取約100180毫升酵母培養物,6000×g,離心10分鐘,盡可能的倒干上清,收集菌體。

收集過50毫升菌液,可以離心棄上清后,在同一個50mL管內加入更多的菌液,重復步驟1,直到收集到足夠的菌體。

加入10mL Sorbitol buffer,輕柔吹打充分重懸細胞;加入0.1g破壁酶(破壁酶臨用前用2mL Sorbitol buffer溶解),充分顛倒混勻,37℃溫育12小時消化細胞壁,中間可顛倒數次幫助消化。

如果破壁效果不好導致質粒產量過低,可以加大破壁酶用量來提高酶工作濃度,還可以延長消化時間或者提高溫度到45℃來提高效果,不適合破壁消化的酵母可選用Lyticase或者Zymolase或者其它方法如加玻璃珠渦旋振蕩,反復凍融等。

6000×g,離心10分鐘,盡可能吸棄上清,加入7mL溶液YP1重懸菌體沉淀,渦旋振蕩至徹底懸浮。

如果有未徹底混勻的菌塊,會影響裂解,導致提取量和純度偏低。

7mL的溶液YP2,溫和地上下翻轉47次使菌體充分裂解,室溫放置4分鐘。

溫和地混合,不要劇烈震蕩,以免基因組DNA剪切斷裂!所用時間不應過5分鐘!以免質粒受到破壞。此時菌液應變得清亮粘稠,如果菌體少,很快清亮粘稠后就可以做下一步,不是一定要準確的5分鐘。如果未變得清亮,可能由于菌體過多,裂解不徹底,應減少菌體量。

10mL溶液YP3,立即溫和地上下翻轉47次,充分混勻此時會出現白色絮狀沉淀。冰上靜置510分鐘,4℃,至少2500×g離心20分鐘(加大離心力可相應縮短離心時間,如15000×g離心10分鐘),小心取上清,避免吸取到漂浮的白色沉淀。

加入溶液YP3后應該立即混勻,以免產生SDS的局部沉淀,如果上清中還有飄浮白色沉淀,可再次離心后取上清。

可選,一般不需要:4℃,2500×g再次離心10分鐘,小心取上清。

將上一步所得上清加入吸附柱DC中(吸附柱放入收集管中),靜置2分鐘,2500×g離心2分鐘,倒掉收集管中的廢液。

如果上清體積過20mL,可以分多次過柱。

加入10mL去蛋白液PD,2500×g離心2分鐘,棄掉廢液。

加入10mL漂洗液WB(請先檢查是否已加入無水乙醇!),2500×g離心2分鐘,棄掉廢液。

重復操作步驟9一次。

將吸附柱DC放回空收集管中,高速(好大于9000×g,如果離心機轉速低,需要相應延長離心時間)離心10分鐘以干燥膜基質殘留乙醇,用槍頭吸除內圈壓環和柱壁之間可能殘留的乙醇,室溫或者烘箱晾干幾分鐘。

該步驟目的為徹底去除吸附柱中殘留乙醇,殘留乙醇抑制下游反應并且嚴重降低洗脫效率,降低質粒產量。如果洗脫產量低,則必須加做步驟12。

可選步驟:選擇以下兩種方法之一干燥柱子:

取下柱子放置于真空容器中,密封真空容器,提供真空15分鐘;

將柱子放置于6065℃真空干燥箱或烘箱中,放置1015分鐘。

取出吸附柱DC,放入一個干凈的離心管中,在吸附膜的中間部位加1mL洗脫緩沖液EB(洗脫緩沖液事先在6570℃水浴中預熱效果更好),室溫放置2分鐘,6000×g離心5分鐘。如果需要較多量質粒,可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中,離心2分鐘。

 

洗脫體積越大,洗脫效率越高,如果需要質粒濃度較高,可以適當減少洗脫體積,但是小體積不應少于0.6mL,體積過小降低質粒洗脫效率,減少質粒產量。

實驗步驟:
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可!固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞,每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml,用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定,不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c.細胞懸液 離心收集細胞,每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol,反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2.將勻漿樣品在室溫(15-30℃)放置5分鐘,使核酸蛋白復合物完全分離。
3.可選步驟:如樣品中含有較多蛋白質,脂肪,多糖或胞外物質(肌肉,植物結節部分等)可于2-8℃10000×g離心10分鐘,取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。處理脂肪組織時,上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,劇烈振蕩15秒,室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層:底層為黃色有機相,上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中,水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中,如要分離DNA和蛋白質可保留有機相,進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇,室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘,離心前看不出RNA沉淀,離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者:上海莼試生物技術有限公司

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