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| 產品名稱 | 英文名稱 | 規格 | 貨號 |
| 高純酵母質粒大量提取試劑盒(100～180mL) | Yeast Plasmid Maxi Kit(100-180mL) | 10次 | CS-01F96585 |
本試劑盒采用改進SDS-堿裂解法裂解細胞并結合破壁酶特異消化酵母細胞壁，能在1小時內從酵母培養液中分離出高純度質粒DNA。酵母收集后，加入破壁酶去除細胞壁后，然后堿裂法裂解細胞，離心吸附柱內的硅基質膜在高鹽、低PH值狀態下選擇性地結合溶液中的質粒DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質和其它細菌成分去除，后低鹽、高PH值的洗脫緩沖液將純凈質粒DNA從硅基質膜上洗脫。
| 試劑盒特點： 離心吸附柱內硅基質膜全部采用進口世界著名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好。克服了國產試劑盒膜質量不穩定的弊端。 快速、方便，不需要使用有毒的、氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀。獲得的質粒產量高、純度好，可以直接用于酶切、轉化、PCR、體外轉錄、測序等各種分子生物學實驗。 保存：室溫儲存12個月不影響使用效果。 保存事項： 次使用時，將試劑盒所帶的全部RNaseA加入溶液YP1（終濃度100μg/ml）置于4℃保存。如果溶液YP1中RNase A失活，提取的質？赡軙形⒘RNA殘留，在溶液YP1中補加RNase A即可。 環境溫度低時溶液YP2中SDS可能會析出渾濁或者沉淀，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復澄清，不要劇烈搖晃，以免形成過量的泡沫。 避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。 操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項） 提示： ① 次使用前請先在漂洗液WB瓶中加入量無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入! ② 將RNase A全部加入溶液P1中，混勻。每次使用后置于2～8℃保存。 ③ 將溶液P3放在冰上預冷。 ④ 吸取使用量的Sorbitol buffer加入0.1%β-巰基乙醇，回復到室溫備用。 取約100～180毫升酵母培養物，6000×g，離心10分鐘，盡可能的倒干上清，收集菌體。 收集過50毫升菌液，可以離心棄上清后，在同一個50mL管內加入更多的菌液，重復步驟1，直到收集到足夠的菌體。 加入10mL Sorbitol buffer，輕柔吹打充分重懸細胞；加入0.1g破壁酶（破壁酶臨用前用2mL Sorbitol buffer溶解），充分顛倒混勻，37℃溫育1～2小時消化細胞壁，中間可顛倒數次幫助消化。 如果破壁效果不好導致質粒產量過低，可以加大破壁酶用量來提高酶工作濃度，還可以延長消化時間或者提高溫度到45℃來提高效果，不適合破壁消化的酵母可選用Lyticase或者Zymolase或者其它方法如加玻璃珠渦旋振蕩，反復凍融等。 6000×g，離心10分鐘，盡可能吸棄上清，加入7mL溶液YP1重懸菌體沉淀，渦旋振蕩至徹底懸浮。 如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導致提取量和純度偏低。 加7mL的溶液YP2，溫和地上下翻轉4～7次使菌體充分裂解，室溫放置4分鐘。 溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免基因組DNA剪切斷裂！所用時間不應過5分鐘！以免質粒受到破壞。此時菌液應變得清亮粘稠，如果菌體少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要準確的5分鐘。如果未變得清亮，可能由于菌體過多，裂解不徹底，應減少菌體量。 加10mL溶液YP3，立即溫和地上下翻轉4～7次，充分混勻此時會出現白色絮狀沉淀。冰上靜置5～10分鐘，4℃，至少2500×g離心20分鐘(加大離心力可相應縮短離心時間，如15000×g離心10分鐘)，小心取上清，避免吸取到漂浮的白色沉淀。 加入溶液YP3后應該立即混勻，以免產生SDS的局部沉淀，如果上清中還有飄浮白色沉淀，可再次離心后取上清。 可選，一般不需要：4℃，2500×g再次離心10分鐘，小心取上清。 將上一步所得上清加入吸附柱DC中（吸附柱放入收集管中），靜置2分鐘，2500×g離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。 如果上清體積過20mL，可以分多次過柱。 加入10mL去蛋白液PD，2500×g離心2分鐘，棄掉廢液。 加入10mL漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），2500×g離心2分鐘，棄掉廢液。 重復操作步驟9一次。 將吸附柱DC放回空收集管中，高速（好大于9000×g，如果離心機轉速低，需要相應延長離心時間）離心10分鐘以干燥膜基質殘留乙醇，用槍頭吸除內圈壓環和柱壁之間可能殘留的乙醇，室溫或者烘箱晾干幾分鐘。 該步驟目的為徹底去除吸附柱中殘留乙醇，殘留乙醇抑制下游反應并且嚴重降低洗脫效率，降低質粒產量。如果洗脫產量低，則必須加做步驟12。 可選步驟:選擇以下兩種方法之一干燥柱子： ① 取下柱子放置于真空容器中，密封真空容器，提供真空15分鐘； ② 將柱子放置于60～65℃真空干燥箱或烘箱中，放置10～15分鐘。 取出吸附柱DC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加1mL洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在65～70℃水浴中預熱效果更好），室溫放置2分鐘，6000×g離心5分鐘。如果需要較多量質粒，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心2分鐘。
洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要質粒濃度較高，可以適當減少洗脫體積，但是小體積不應少于0.6mL，體積過小降低質粒洗脫效率，減少質粒產量。 |
原創作者：上海莼試生物技術有限公司
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