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本試劑盒使用特殊的結合緩沖液能夠高效純化>15nt的單鏈或者雙鏈DNA和RNA。特別適用于從標記反應（標記，同位素標記，標記等）混合物中回收小片段標記探針，去除未反應的核苷酸、短oligos、染料、酶、鹽離子等。典型的回收率高達80～90%，每個離心吸附柱每次可吸附的DNA量為10μg。使用本試劑盒回收的RNA或者DNA可適用于in Situ Hybridization、Northern blot、RNAi、Gel shift assay、Ligation、Sequencing、Microarray analysis等實驗。

產品特點：

離心吸附柱內硅基質膜全部采用進口世界著名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好。

使用了優質結合液，不含傳統結合液的碘化鈉和高氯酸鹽，不抑制回收后酶切、連接克隆等下游反應。

獨特的配方保證了該試劑盒比一般試劑盒回收效率大大提高。并且適用于回收單鏈或者雙鏈DNA和RNA。

快速、方便，不需要使用有毒的、氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀。

保存事項：

室溫保存，有效期12個月。避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。

平衡液：

介紹：核酸吸附硅膠膜柱子長期放置過程中會同空氣中的電荷/塵埃發生反應而影響其核酸的結合能力。硅膠柱經平衡液預處理后可大大減少柱子中硅膠膜的憎水基團，提高核酸的結合能力。從而提高硅膠柱子回收效率或者產量。平衡液是堿性溶液，若不小心碰到，請用大量自來水清洗。用完后需蓋緊瓶蓋，以免接觸空氣。室溫保存。在保存過程中可能有沉淀生成，請加熱至37℃使沉淀完全消失。

什么情況下使用：一般剛買來2,3個月的新硅膠柱子不需要使用平衡液。時間存放較長吸附效率降低的硅膠柱子，可使用平衡液進行預處理來提高硅膠柱子結合能力從而提高核酸產量。或者預期片段難回收，或者回收起始量低預期產量低的情況，也可使用平衡液來提高回收效率。

使用方法：取一個新的硅膠膜吸附柱子裝在收集管中，吸取100μL的平衡緩沖液至柱子中。13000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，將吸附柱子重新放回收集管。此時平衡液預處理柱子完畢。接后續的操作步驟。

操作步驟：

提示：次使用前請先在漂洗液RW中加入量無水乙醇，加入后請及時打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!

估計樣品體積（低體積50μL，不夠可用滅菌水補足；回收RNA需要用RNase free H2O補足），向其中加入10倍體積的結合液OB，溫和地充分混勻（PCR反應體系無需去除石蠟油或礦物油）。

回收>100bp片段時候，只需要加5倍體積結合液OB。

將上一步所得溶液加入吸附柱EC中（吸附柱放入收集管中），室溫放置1分鐘，12000rpm離心30～60秒，倒掉收集管中的廢液。

吸附柱大容積為720μL，若溶液體積大于720μL，可分批加入。

加入500μL漂洗液RW（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12000rpm離心30秒，棄掉廢液。

加入500μL漂洗液RW，12000rpm離心30秒，棄掉廢液。

將吸附柱EC放回空收集管中，13000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。

取出吸附柱EC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加30～50μL RNasefree H2O，室溫放置2分鐘，12000rpm離心1分鐘。如果需要較高濃度核酸，可將得到的溶液重新加入吸附柱中，離心1分鐘。

洗脫體積越大，洗脫效率越高。如果需要核酸濃度較高，可以適當減少洗脫體積，但是小體積不應少于25μL，體積過小降低核酸洗脫效率，減少產量。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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