產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
RNase A溶液(無DNase和蛋白酶活性)	DNase-free, Protease-free RNase A (10mg/ml)	1ml	CS-01F96574

RNase A常見的應用在于質(zhì)粒DNA或基因組DNA制備過程中去除RNA，因此制備過程中DNase酶活性的存在與否是需要重視的污染之一，可采用水浴煮沸這種傳統(tǒng)方法來滅活DNase活性。本品不含DNase和蛋白酶，使用前無需熱處理。另外，本品還可用于RNA酶保護分析、RNA序列分析等分子生物學實驗。

核糖核酸酶A（Ribonuclease A，RNase A），一種含4個二硫鍵的單鏈多肽，分子量約為13.7kDa。作為一種核糖核酸內(nèi)切酶（endoribonuclease），特異性降解單鏈RNA上的胞（C）或（U）殘基。具體來說，切割識別的是由某核苷酸上的5’-核糖和相鄰的類核苷酸3’-核糖上磷酸基團形成的磷酸二酯鍵，從而使得2’,3’-環(huán)磷酸水解為對應的3’-核苷磷酸（比如，pG-pG-pC-pA-pG經(jīng)RNase A切割產(chǎn)生pG-pG-pCp和A-PG）。

RNase A切割單鏈RNA活性高，且在多種反應條件下均有活性：在低鹽濃度（0-100mM NaCl）下，可用來切割單鏈RNA、雙鏈RNA以及RNA-DNA雜交形成的RNA鏈，而高鹽濃度（≥0.3M）下，RNase A僅特異性切割單鏈RNA。

本品以溶液形式提供，濃度為10mg/mL。推薦工作濃度為1-100μg/mL，因應用類型的不同而異。

貯存液：50mM Tris-HCl (pH7.4)和50% (v/v)甘油

儲存條件：-20℃。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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