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RNase A溶液(100mg/ml)

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  • 產品產地：國產
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  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：RNase A溶液(100mg/ml)現貨供應，價格實惠。

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RNase A溶液(100mg/ml)

Ribonuclease A(100mg/ml)

1ml

CS-01F96573

RNase A常見的應用在于質粒DNA或基因組DNA制備過程中去除RNA，因此制備過程中DNase酶活性的存在與否是需要重視的污染之一，可采用水浴煮沸這種傳統方法來滅活DNase活性。另外，本品還可用于RNA酶保護分析、RNA序列分析等分子生物學實驗。

核糖核酸酶A（Ribonuclease A，RNase A），一種含4個二硫鍵的單鏈多肽，分子量約為13.7kDa。作為一種核糖核酸內切酶（endoribonuclease），特異性降解單鏈RNA上的胞（C）或（U）殘基。具體來說，切割識別的是由某核苷酸上的5’-核糖和相鄰的類核苷酸3’-核糖上磷酸基團形成的磷酸二酯鍵，從而使得2’,3’-環磷酸水解為對應的3’-核苷磷酸（比如，pG-pG-pC-pA-pG經RNase A切割產生pG-pG-pCp和A-PG）。

RNase A切割單鏈RNA活性高，且在多種反應條件下均有活性：在低鹽濃度（0-100mM NaCl）下，可用來切割單鏈RNA、雙鏈RNA以及RNA-DNA雜交形成的RNA鏈，然而高鹽濃度（≥0.3M）下，RNase A僅特異性切割單鏈RNA。

本品以溶液形式提供，濃度為100mg/ml。推薦工作濃度為1-100μg/ml，因應用類型的不同而異。

貯存液：為50mM Tris-HCl (pH7.4)和50% (v/v)甘油。

 

保存溫度：-20℃
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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